基于NLRP3-神經遞質通路初步探究知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織的調控機制

王娟霞，譚有珍，郭明鑫，史可欣，吳 霞，馮毅凡

廣東藥科大學新藥研發中心，廣州 510006

隨著人們生活方式和飲食結構的改變，肥胖發生率不斷上升，目前這一問題已經開始涉及發展中國家和第三世界國家，成為全球公共衛生問題[1]。肥胖是一種機體脂肪組織積累過多的狀態，根據脂肪組織在體內蓄積的部位不同分為脂肪型肥胖和腹型肥胖。研究發現肥胖患者內臟脂肪組織中的巨噬細胞(ATMs)有明顯的浸潤現象和大量促炎細胞因子的表達[2]，這些細胞表型呈現出一種從M2轉變為M1(炎性)的特殊狀態，此狀態會加速脂肪組織慢性炎癥的發生，并使ATMs內的NLRP3表達增加，其表達增加會激活下游GDF3的表達，進而上調MAOA等兒茶酚胺水解酶的水平[3]，最終引起脂肪組織中兒茶酚胺類神經遞質含量減少，脂質分解能力降低，產生脂肪蓄積，造成腹型肥胖。

知母總皂苷(saponins fromAnemarrhenaasphodeloidesBge.，SAa B)是從知母中提取分離出的含量最為豐富的有效成分[4]，具有降糖[5]、抗炎[6]、抗氧化[7]、抗血栓[8]、改善抑郁[9]等藥理活性。本課題組前期初步研究發現，SAa B對糖尿病大鼠具有降糖降脂等作用[10]，而糖尿病與肥胖、脂質代謝有著密切的關系[11]，然而，SAa B對肥胖是否具有干預作用目前尚不清楚，缺乏藥理作用機制研究。因此，本研究通過高脂飲食誘導C57BL/6J雄性小鼠肥胖模型，考察SAa B對肥胖小鼠的干預作用及脂肪組織中相關基因表達的調節作用，以期闡釋其調節肥胖的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠，48只，3周齡，體質量18.0 ± 2.0 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號SCXK(粵)2018-0002，飼養于廣東藥科大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK(粵)2017-0125。本研究所涉及的動物實驗經廣東藥科大學實驗動物中心倫理委員會審查批準，編號gdpulacspf2017156。

1.2 藥物與試劑

知母總皂苷粉末，實驗室自制，含量大于80%；氯吉蘭(美國TargetMol公司，批號17780755)；60%脂肪熱量高脂飼料(美國Research Diets公司，批號D16492)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司，貨號#K1622)；SYBRGreen PCR試劑盒(貨號G3008)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號G2026);核苷酸寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3,貨號GB15101);單胺氧化酶A(MAOA,貨號GB11026);β-肌動蛋白(β-actin)抗體(貨號GB12001);辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(貨號GB23303)均購自武漢Servicebio公司；試劑均為國產分析純。

1.3 儀器設備

ACCU-CHEK Performa血糖儀(德國Roche公司)；URIT-8021A全自動生化分析儀(常州銳品精密儀器有限公司)；LCT-200小動物CT儀(日本ALOCA公司)；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機(中國DragonLab公司)；Stepone plus熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)；Rt2100c酶標檢測儀(美國Rayto公司)；DYCZ-24DN 雙垂直電泳儀，DYCZ-40D轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；V300掃描儀(日本EPSON公司)；AlphaEaseFC灰度分析軟件(美國AlphaInnotech公司)；Adobe PhotoShop圖像分析軟件(美國Adobe公司)；Nikon Eclipse E100正置光學顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 肥胖模型建立及分組干預

48只雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組和實驗組，正常組給予標準普通飼料，實驗組給予高脂飼料，喂養7周，每天記錄小鼠體重。造模結束后，將肥胖模型復制成功[12,13]的小鼠隨機分為氯吉蘭組、知母總皂苷低、中、高劑量組(SAa B-L、SAa B-M、SAa B-H)和模型組，繼續給予高脂飼料，同時分別腹腔注射氯吉蘭3 mg/kg和SAa B 30、60、90 mg/kg，每日1次，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，持續給藥7周。

2.2 肥胖小鼠相關指標的檢測

各組小鼠在實驗前禁食12 h，不禁水，尾靜脈采血，用血糖儀測定各組小鼠空腹血糖值。眼內眥靜脈采血，低溫靜置10 min，于4 ℃條件下3 000 rpm離心15 min，取上層血清，用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血脂水平，測定步驟嚴格按總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高、低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C、LDL-C)試劑盒說明書進行。實驗結束后，用水合氯醛將各組小鼠麻醉后頸椎脫位處死，解剖采集腹部內壁脂肪，冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重。

2.3 小動物CT活體影像技術(Micro CT)

給藥結束后，用水合氯醛麻醉小鼠，將麻醉后的各組小鼠裝入holder后放入小動物CT儀，確定掃描視野，選擇掃描模式，進行scout掃描，得到樣本的二維圖片，在二維圖片上選擇掃描范圍后，進行CT掃描，掃描結束后瀏覽斷層圖片，選定ROI，用Latheta v3.61選擇脂肪進行分析。

2.4 脂肪組織形態學檢測

取各組小鼠脂肪組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，進行脫水后石蠟包埋，切片，用蘇木素-伊紅(HE)染色，封片并在光學顯微鏡下觀察各組小鼠脂肪組織病理形態學變化。

2.5 Real-time PCR檢測小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA的表達

嚴格按照操作手冊，采用trizol提取各組小鼠脂肪組織中的RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA純度，以提取的mRNA為模板逆轉錄為cDNA，以GAPDH為內參，檢測生長分化因子3(GDF3)、天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)、白細胞介素-1β(IL-1β)的相對表達量，PCR擴增產物運用2-ΔΔCt法計算各目的基因的表達量。目的基因引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物信息見表1。反應體系為2×Taq MasterMix 12.5 μL，上游和下游引物各2.0 μL，cDNA2.5 μL，無RNA/DNA酶水8.0 μL。反應條件為95 ℃維持10 min，95 ℃預變性15 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，重復循環40次。

表1 Real-time PCR引物序列

2.6 Western blot法檢測小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達

取各組小鼠脂肪組織，置于冰上破碎勻漿，加入RIPA蛋白裂解液充分裂解后15 000 rpm離心5 min，取上清并用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據所需樣本體積，按4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水浴變性15 min。配制分離膠和濃縮膠，用SDS-PAGE分離變性的蛋白，并轉移至PVDF轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，1×TBST等滲緩沖溶液洗去奶粉溶液，按抗體說明書加入相應的NLRP3、MAOA蛋白一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶3 000)，室溫脫色搖床上搖動封閉30 min，用化學發光試劑ECL發光液潤濕，將膠片掃描存檔并用Alpha軟件處理系統分析蛋白灰度值并計算蛋白相對表達量。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 知母總皂苷對肥胖小鼠相關指標的影響

與正常組比較，模型組小鼠給藥前體質量和脂肪重量均明顯增高(P< 0.05)，表明高脂飼料長期喂養的小鼠產生肥胖，模型組末次給藥后小鼠體質量較正常組明顯增高(P< 0.05)，表明實驗過程中肥胖小鼠模型穩定；與模型組比較，氯吉蘭組與SAa B三個劑量組末次給藥后小鼠體質量明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組與SAa B-M、SAa B-H組末次給藥后小鼠脂肪重量明顯降低(P< 0.05)(見表2)。

表2 知母總皂苷對肥胖小鼠體質量和脂肪分布的影響

肥胖主要由于長期能量平衡失衡所致體內脂肪異常分布或堆積過多，并伴隨血糖和血脂異常[14]。與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖值、TC、TG、LDL-C水平均明顯升高(P< 0.05)，HDL-C水平明顯降低(P< 0.05)，表明肥胖小鼠體內血糖、血脂代謝出現紊亂；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-H組小鼠空腹血糖值明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組TC水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B三個劑量組TG，LDL-C水平均明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組HDL-C水平明顯升高(P< 0.05)(見表3)。

表3 知母總皂苷對肥胖小鼠空腹血糖、血脂水平的影響

3.2 知母總皂苷對肥胖小鼠腹部脂肪的影響

與正常組觀察比較，模型組小鼠下腹腔內壁脂肪組織明顯增加(圖1中粉色部分)，氯吉蘭組與SAa B-M、SAa B-H組小鼠下腹腔內壁脂肪組織減少(見圖1)。

圖1 小鼠下腹部CT橫截圖Fig.1 CT cross-sectional of lower abdomen of mice注：圖中白色為骨頭；藍色為肌肉組織；粉色為下腹腔內壁脂肪組織；黃色為皮下脂肪。A：正常組；B：模型組；C：氯吉蘭組；D～F：知母總皂苷低、中、高劑量組；下同。Note:White is bone;Blue is muscle;Pink is adipose tissue lining the lower abdominal cavity;Yellow is subcutaneous fat.A:Control group;B:Model group;C:Clorgiline group;D-F:SAa B-L,SAa B-M,SAa B-H;The same below.

3.3 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織病理改善情況

正常組小鼠脂肪組織細胞排列緊密，大小均勻，未見明顯異常；模型組肥胖小鼠脂肪組織細胞大小不均勻，少量細胞胞質斷裂，鄰近脂滴空泡融合成大空泡，提示脂肪組織細胞損傷；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B各劑量組肥胖小鼠脂肪組織細胞損傷均有不同程度的改善，脂肪空泡體積變小，其中SAa B-H組肥胖小鼠脂肪組織病理狀態改善程度明顯，表明SAa B能改善肥胖小鼠脂肪組織病理形態學變化(見圖2)。

圖2 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織病理學的影響(HE，×200)Fig.2 Effect of SAa B on adipose tissue histopathology of obese mice (HE,×200)

3.4 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達的影響

各組小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達水平結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達水平明顯升高(P< 0.05)；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中GDF3mRNA表達水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B-H組小鼠脂肪組織中Caspase-1和IL-1βmRNA表達水平明顯降低(P< 0.05)，該結果表明SAa B-H可抑制肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達水平(見表4)。

表4 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達的影響

3.5 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達的影響

各組小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白表達結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織中NLRP3和MAOA蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，氯吉蘭組和SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中NLRP3蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)，氯吉蘭組和SAa B三個劑量組小鼠脂肪組織中MAOA蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)，且呈劑量依賴性，該結果表明SAa B-M、SAa B-H可抑制肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、MAOA蛋白的表達水平(見圖3)。

圖3 知母總皂苷對肥胖小鼠脂肪組織NLRP3、MAOA蛋白表達的影響Fig.3 Effect of SAa B on the expression levels of NLRP3,MAOA protein in adipose tissue of obese mice n =8)

4 討論

脂肪組織是機體的重要器官，其主要功能是儲存和分泌脂肪酸(FFAs)，平衡機體血糖和血脂，還會分泌各種激素和細胞因子，影響能量代謝，參與炎癥反應[15,16]。研究表明，隨著年齡的增大，炎癥和胰島素抵抗發病率升高，從而引起脂肪組織機能衰退，產生腹部和內臟周圍脂肪聚積，進而導致腹型肥胖[17]。在本研究中長期高脂飲食引起小鼠體質量增加，血糖、TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低，腹部周圍脂肪蓄積，造成腹型肥胖。

本課題組前期實驗[18]及Fu等[19]研究發現，SAa B可降低血漿中膽固醇及低密度脂蛋白水平，并具有降血糖的功效，但其具體作用機制尚不清楚。本研究通過SAa B干預肥胖小鼠模型發現，SAa B-H組肥胖小鼠的體質量降低，腹部周圍脂肪減少，空腹血糖值和血清中TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，脂肪組織病理狀態改善，與上述研究結果一致。

大量脂肪蓄積會引起脂肪本身降解并且產生游離脂肪酸(FFAs)，產生的FFAs會刺激脂肪組織中的巨噬細胞生成神經酰胺，誘導局部組織炎癥反應，從而加快肥胖的發展[20-22]。NLRP3能夠調控機體慢性炎癥反應[23]，其可被FFAs等代謝產物激活[24]，在高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織中NLRP3、GDF3、Caspase-1表達水平上調，進而上調兒茶酚胺類水解酶的表達和IL-1β水平，而兒茶酚胺類神經遞質，是體內最重要的脂肪分解刺激激素[25]。本研究發現，肥胖小鼠脂肪組織中GDF3、Caspase-1、IL-1β、NLRP3、MAOA的表達上調，在SAa B治療7周后，SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中GDF3mRNA表達水平降低，SAa B-H組小鼠脂肪組織中Caspase-1、IL-1βmRNA表達水平降低；SAa B-M、SAa B-H組小鼠脂肪組織中NLRP3蛋白表達水平降低，SAa B-L、SAa B-M、SAa B-H小鼠脂肪組織中MAOA蛋白表達水平降低，以上結果表明，SAa B能夠干預肥胖小鼠脂肪組織炎癥的發生，降低兒茶酚胺類水解酶的表達，進而提高脂肪組織中兒茶酚胺類神經遞質水平，改善脂類分解能力。

綜上所述，SAa B可以降低肥胖小鼠的體質量和脂肪重量，改善肥胖引起的血糖血脂代謝紊亂和脂肪組織的病理狀態，能夠增強肥胖小鼠的脂質分解能力，緩解肥胖癥狀，其作用機制可能是通過NLRP3-神經遞質通路抑制兒茶酚胺類水解酶的分泌和炎性因子表達，提高脂質分解能力和減輕炎癥反應，在后續的研究中可通過基因沉默、基因敲除等技術做進一步驗證，為中藥對肥胖癥的預防和治療提供新的理論依據。