姜黃素對大鼠運動性心肌纖維化的保護作用

牛衍龍，曹建民，王 禎，周海濤，張 靜，胡 戈，程鑫云，蔡博文

1贛南醫學院康復學院；2贛州市康復醫學重點實驗室，贛州 341000；3北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084；4北京聯合大學；5北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100101；6常州大學體育學院，常州 213164

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是心肌損傷后出現的以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積、膠原成分比例失衡為特征的病理過程，與多種心臟疾病(心肌梗死、慢性心力衰竭、心房纖顫等)關系密切[1]。研究表明，過度的生理應激可引發心肌組織炎癥反應并導致心肌纖維化及心肌損傷[2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員p38 MAPK，在病理或生理應激下被激活后可通過磷酸化絲裂原和應激蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1，MSK1)激活核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[3]。NF-κB是炎癥反應的主要調控因子，由同源與異源NF-κB/Rel蛋白二聚體構成，活化后入核，誘導轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎因子的表達，其中TGF-β1是機體肌肉組織纖維化主要誘導因子[4]。姜黃素是多年生植物姜黃中提取的生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌和神經保護等多種生理和藥理活性[5]。課題組前期研究證實[6-8]，訓練期間的姜黃素干預可以延緩和抑制過度運動應激誘發的氧化應激和運動性心肌損傷，同時可有效地抑制過度運動應激誘發炎癥反應，下調TGF-β1等促炎因子含量，改善運動性腎臟纖維化，保護腎臟功能/結構。本研究采用6周遞增負荷跑臺訓練建立長時程、大強度運動致運動性臟器損傷動物模型[9]，探究姜黃素通過調控p38 MAPK/NF-κB信號通路相關蛋白質活化和表達，抑制心肌組織炎癥因子的合成，緩解長時程、大強度運動所致心肌ECM過度沉積，進而改善心肌纖維化的機制。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

44只49天齡雄性SD大鼠，體重200～220 g，購于北京大學醫學部實驗動物科學部，許可證編號：SCXK(京)2016-0010。標準實驗動物環境下飼養(溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，晝夜交替各12 h)。基礎飼料由中華人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物飲用蒸餾水(不限制進食量)。實驗周期46天，遞增負荷訓練42天。

1.2 實驗藥物與試劑

姜黃素(純度>99%，陜西源泰生物科技公司，批號：17012571)；羧甲基纖維素鈉(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；大鼠TGF-β1、TNF-α、IL-1β和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinc I，cTNI)ELISA試劑盒(美國Abcam公司，試劑盒批號：ab119558，ab100785，ab100768，ab246529)；p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65抗體(德國Sigma-aldrich公司，抗體批號：SAB4500491、M8177、SAB4502615)。

1.3 儀器

動物跑臺(杭州段式制造廠)；7020 全自動生化分析儀(HITACHI公司，日本)；Wellscan MK3 酶標儀(雷博公司，美國)；RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；E100正置光學顯微鏡(Nikon公司，日本)；Pannoramic MIDI全自動數字切片掃描系統(3D HISTECH公司，匈牙利)；Allegra 25R臺式高速離心機(Beckman Coulter公司，美國)；NR-B17CC超低溫冰箱(Panasonnic 公司，日本)；ISO9001電子天秤(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 動物訓練與給藥

44只7周齡SD大鼠適應性喂養4天后，隨機分組：對照組(control group，C組，12只)，模型組(model group，M組，16只)和姜黃素+模型組(curcumin+model group，CM組，16只)。C組安靜飼養，不進行任何運動干預；M組、CM組采用6周遞增負荷跑臺訓練(參考相關文獻[10]并結合前期研究[9])，具體方案如圖1。姜黃素以0.5%羧甲基纖維素鈉配制成懸濁液，CM組于每日訓練前1 h進行灌胃(200 mg/kg，5 mL/kg)[6-9]，其余組于同一時間點以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

圖1 大鼠跑臺訓練方案Fig.1 Treadmill modeling program of rat注：從第二周開始，每次訓練初始速度為10 m/min，每5 min增加5 m/min，直到本周目標強度。最后一周訓練，大鼠若無法維持目標強度，則運動至力竭。Note:Training started from 10 m/min and increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of this week from 2nd week.During the last week of training,if the rats could not maintain the target speed,they would exercise to exhaustion.

2.2 取材與標本制作

受訓練強度等因素影響，M組、CM組大鼠均出現意外死亡，分別剩余13只、15只。

末次訓練結束24 h，2%濃度的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 000 rpm離心10 min分離血清后放入-20 ℃冰箱保存待測。快速分離心臟，置于預冷的生理鹽水中洗清血污。切取1 mm×1 mm×1 mm心尖處心肌組織，放入2.5%戊二醛制備透射電鏡樣品；另切取部分右心室心肌組織放入4%多聚甲醛固定；剩余心臟組織錫紙包裹后投入液氮暫存，而后轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 心肌組織病理學檢測

取出戊二醛固定液中的心肌組織，1×PBS和蒸餾水分別洗3次，1%鋨酸固定后蒸餾水洗3次，2%鈾染1 h，蒸餾水洗后(鋁箔中脫水)分別浸入梯度丙酮(30%、50%、70%、90%、無水丙酮)，滲透過程為樹脂：丙酮1∶3混合液1 h，樹脂：丙酮1∶1混合液2 h，樹脂：丙酮2∶1混合液過夜，經過3次樹脂滲透后過夜，次日60 ℃烘箱高溫聚合，精修組織塊，切片機制成1 μm切片并撈至銅網中，透射電鏡觀察心臟超微結構。

取出多聚甲醛固定液中的心肌組織，流水沖洗24 h，梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、無水乙醇)脫水，二甲苯透明后石蠟滲透，溫度保持在62 ℃，包埋機包埋，橫斷面切片(厚度為4 μm)烘干，HE染色觀察心臟組織病理學改變。

2.4 心肌組織纖維化程度檢測

心肌組織石蠟切片脫蠟至水，PAS染色液染色，脫水，封片。顯微鏡鏡檢，每個心肌組織標本隨機選取5個視野，采用ImageJ圖像分析系統分析心肌糖原容積分數(心肌糖原容積分數=視野內糖原總面積/視野心肌組織總面積)，評定心肌纖維化程度。

2.5 心肌損傷及炎癥因子測定

酶聯免疫吸附法檢測血清中心肌損傷因子cTNI和心肌組織中炎癥因子TGF-β1、TNF-α和IL-1β含量。

2.6 心臟組織蛋白質表達量測定

免疫組織化學法檢測心肌組織p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白質表達。取心臟組織石蠟切片進行脫蠟脫水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、一抗與二抗孵育、DAB染色、復染細胞核、封片等操作，數字掃描儀進行斷面全景掃描，計算組織化學評分[11]：細胞核陽性由強至弱依次為深棕、棕黃、淺黃，藍色為陰性。H-score =(淺黃色細胞密度×1)+(棕黃色細胞密度×2) +(深棕色細胞密度×3)。

2.7 數據統計

3 結果

3.1 大鼠體重變化

由圖2可知，實驗正式開始前，各組大鼠體重組間無顯著性差異(P>0.05)；6周訓練結束后，M組、CM組均顯著低于C組(P<0.01)，而組間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠體重變化Fig.2 Weight changes of rats注：與C組比，##P<0.01。Note:Compared with group C,## P<0.01.

3.2 大鼠心肌組織形態學及超微結構變化

400倍光鏡下觀察大鼠右心室心肌組織形態。由圖3可知，C組心肌纖維橫紋清晰，排列整齊，肌細胞邊界明確，細胞質呈紅色，細胞核呈深藍色且分布相對均勻，無明顯炎癥浸潤。M組心肌纖維出現斷裂，細胞核出現固縮現象，細胞邊界模糊不清，并有炎癥浸潤、結締組織增生。CM組無明顯異常，與C組相似。

圖3 大鼠心肌組織形態學變化(HE,×400)Fig.3 Pathological changes in myocardial tissue of rats(HE,×400)

6 000倍透射電鏡下觀察大鼠心肌纖維超微結構。由圖4可知，C組肌絲束結構正常，A帶、I帶、H帶和Z帶分布正常，線粒體結構正常；M組肌纖維線粒體嵴短縮，并由部分出現空泡變性。CM組與C組相似。

圖4 大鼠心肌組織超微結構(TEM,×6000)Fig.4 Ultrastructure of rat myocardial tissue(TEM,×6000)

3.3 大鼠心肌組織ECM沉積

400倍光鏡下觀察PAS染色后心肌組織，并計算心肌糖原容積分數。由圖5、表1可知，大鼠心肌糖原容積分數，M、CM組顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，CM組顯著低于M組(P<0.05)。

圖5 大鼠心肌組織ECM沉積情況(PAS ×400)Fig.5 ECM deposition in myocardial tissue of rats(PAS ×400)

表1 大鼠心肌組織糖原容積分數

3.4 大鼠心肌組織炎癥因子的含量變化

由表2可知，血清中心肌損傷因子cTNI含量：M組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；心肌組織TGF-β1含量：M、CM組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；TNF-α：M、CM組顯著高于C組(P<0.01，P<0.05)，CM組顯著低于M組(P<0.01)；IL-1β：M、CM組顯著高于C組(P<0.01)，CM組顯著低于M組(P<0.05)。

表2 大鼠心肌損傷標志物及炎癥因子含量

3.5 大鼠心肌組織相關信號通路蛋白質表達

選取400倍光鏡視野并計算相關信號通路蛋白質的組織化學評分(H-Score)，由圖6、表3可知：p38 MAPK，各組間無顯著性差異(P>0.05)；p-p38 MAPK，M組顯著高于C和CM組(P<0.01)；而p-p38 MAPK/p38 MAPK，M組較C和CM組有升高趨勢，但組間無顯著性差異(P>0.05)；NF-κB p65，M組顯著高于C組(P<0.01)，而CM組顯著低于M組(P<0.05)。

表3 大鼠心肌組織相關信號通路蛋白質表達(H-score)

圖6 大鼠心肌組織相關信號通路蛋白質表達水平Fig.6 Expression of signaling pathway proteins in myocardial tissue of rats

4 討論

長時程、過度的運動應激使得心臟長時間保持較高的心輸出量，心室長期過度擴張引發心肌纖維化，并逐漸發展成為慢性心肌損傷，心率失常風險明顯增加[12]。Breuckmann等[13]利用磁共振延遲釓強化技術發現馬拉松運動愛好者心肌纖維化發病率較高，易于普通人發生心肌損傷。Rao[10]造模長時程、大強度運動致大鼠心肌損傷發現，過度運動應激破壞了心肌組織ECM的合成與降解間的動態平衡狀態，ECM沉積加劇，誘發心肌纖維化，同時血液中心肌損傷標志物cTNI濃度增加，心臟功能/組織形態/超微結構異常。體重變化可以反映運動強度對機體的影響。本研究結果顯示，模型組大鼠由于訓練強度超出機體所能承受的運動負荷，大量消耗能量物質，體重較對照組明顯下降，同時心肌糖原容積分數增加，血清cTNI含量顯著升高，心肌組織形態及超微結構亦發生病理性改變。說明本研究所采用6周跑臺遞增負荷訓練方案由于過度運動應激使得大鼠心肌組織ECM過度沉積及反應性心肌纖維化，進而引發心肌功能/結構損傷。以上結果與前人研究結果一致。

慢性炎癥反應的累積效應可引發心肌纖維化[14]。MAPKs族中主要成員p38 MAPK可以在轉錄水平或翻譯水平調節相關基因表達或蛋白質合成，在炎癥、細胞凋亡等應激反應中發揮重要作用。Aschar-Sobbi等[12]發現小鼠在6周大強度運動訓練后，p38 MAPK表達增加，小鼠心房出現巨噬細胞浸潤，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達增加，心肌纖維化，同時再以p38 MAPK抑制劑干預后運動誘導的心房纖顫和纖維化得到抑制。NF-κB作為快速誘導轉錄因子在機體炎癥反應中發揮主要作用，調控TGF-β1、TNF-α等炎癥因子表達[15]。Stambe等[16]研究發現阻斷p38 MAPK活化，可有效抑制腎組織的炎癥損傷。TGF-β1是心肌纖維化主要誘導因子，過度表達可破壞心肌組織ECM合成與降解平衡：①誘導smad復合物的形成與入核，調控目標基因激活成纖維細胞，合成大量膠原蛋白等ECM組分，導致ECM過度沉積；②通過增強TIMP-1的表達，抑制MMP的活性，使ECM降解減少[17]。姜黃作用廣泛，常被用于香料、食品添加劑和草藥。姜黃素作為姜黃中具有生物活性的多酚提取物，對人體的健康益處主要體現在抑制炎癥和抗氧化等方面[18]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK雖未出現顯著性變化，但呈現上升趨勢，而p-p38 MAPK及NF-κB p65蛋白質表達顯著上升，心肌纖維化因子TGF-β1及相關炎癥因子含量升高，心肌ECM過度沉積；而訓練過程中施以姜黃素干預后，與模型組比較，大鼠心肌p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK雖未出現顯著性變化，但呈現下降趨勢，p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白質表達顯著下調，TGF-β1及相關炎癥因子等含量隨之降低，心肌ECM沉積得到緩解；同時心臟功能/組織形態/超微結構均得到有效改善。Topcu-Tarladacalisir等[19]對潰瘍性結腸炎模型大鼠進行姜黃素干預后發現，p38 MAPK磷酸化水平下降，恢復MAPKs的免疫反應特性，減輕炎癥反應及脂質過氧化程度。本課題組前期研究證實[8]，姜黃素可有效地抑制過度運動應激導致的大鼠腎臟炎癥反應，下調TGF-β1等促炎因子含量，恢復ECM合成與降解平衡。綜上可知，長期大強度訓練過程中補充姜黃素可有效阻斷運動性心肌纖維化的發生發展，其可能機制為姜黃素通過抑制心肌組織內p38 MAPK的過度活化，下調NF-κB p65的蛋白質表達，降低炎癥因子特別是心肌纖維化誘導因子TGF-β1的合成與分泌，改善ECM合成與降解間的平衡，緩解心肌纖維化。

由此可見，姜黃素可以通過調控p38 MAPK/NF-κB信號通路，有效抑制長時程、大強度運動大鼠心肌炎癥反應，緩解心肌纖維化，保護心臟結構/功能。