蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜類化合物在巨噬細胞中的抗炎活性研究

姜明言，饒凱瑞，廖彩岑，劉 歡，李洪梅，李蓉濤，劉 丹

昆明理工大學 生命科學與技術(shù)學院，昆明 650500

炎癥是對刺激、組織損傷和感染做出的一種正常保護性反應，是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和愈合所必需的生理過程[1]。在炎癥過程中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高水平的促炎介質(zhì)在宿主細胞防御中發(fā)揮重要作用[2,3]。然而，不受控制或長時間的炎癥反應是產(chǎn)生機體損傷或慢性疾病如癌癥、風濕性關(guān)節(jié)炎和血管疾病等的重要原因。單核細胞和巨噬細胞是天然免疫的重要防線也是一系列促炎細胞因子的重要來源。當巨噬細胞受到病原體或內(nèi)源刺激時，它們分泌包括腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL-1、IL-6和IL-12)[4]在內(nèi)的多種細胞因子，以及趨化因子、前列腺素、白三烯和補體等，所有這些炎癥介質(zhì)協(xié)同作用，增強血管通透性和招募免疫細胞。目前常用的非甾體抗炎藥(NSAIDs)尚存在胃損傷、支氣管痙攣、腎臟和心臟損傷等不良反應[5]。因此，從傳統(tǒng)中藥中發(fā)掘新的低毒副作用的天然抗炎藥物具有重要的意義。

蜘蛛香ValerianajatamansiJones，系敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(ValerianaL.)植物，主要分布于中國云南、貴州、四川等地，是我國多民族常用的傳統(tǒng)草藥。其根莖具有鎮(zhèn)靜安神、理氣止痛、消炎止瀉、祛風除濕等多重功效，可用于脘腹脹痛，跌打損傷，嘔吐泄瀉，風濕痹痛，月經(jīng)不調(diào)，瘡癤等癥的治療[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，其化學成分主要有環(huán)烯醚萜類，黃酮類，揮發(fā)油等[9-11]。藥理學研究表明，主要成分之一環(huán)烯醚萜類化合物具有抗菌、抗氧化、抗病毒等作用。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)蜘蛛香中分離得到的環(huán)烯醚萜類化合物具有一定的抗流感病毒活性[12]。為了進一步尋找其中的活性物質(zhì)，我們對該部位進行了系統(tǒng)的化學研究，對從中分離得到的14個環(huán)烯醚萜類化合物進行了抗炎活性檢測，并對具有明顯抗炎活性化合物的相關(guān)作用機制進行了進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

蜘蛛香的干燥根與根莖于2017年10月購自昆明市新螺螄灣藥材市場，由昆明理工大學鐘金棟副教授鑒定為蜘蛛香ValerianajatamansiJones，標本存放于昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院資源藥物化學重點實驗室(標本號為KUMST20171001)。

羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)(Pharmacia公司)；MCI CHP-20P(75～150 μm，日本Mitsubishi公司)；脂多糖(LPS)(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)基(Thermofisher公司)；Griess試劑、一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)(碧云天公司)；MTT、DMSO(Solarbio公司)；ELISA試劑盒：IL-6、IL-1和TNF-α(R&D生物試劑公司，Minneapolis，USA)；單克隆一抗和山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)。Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent公司)；VG Autospec-3000質(zhì)譜儀(英國VG公司)；CO2恒溫培養(yǎng)(Thermofisher公司產(chǎn)品)；Spectra Max M2多功能讀板機(美國Moleccular Devices 公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取和分離

干燥的蜘蛛香根及根莖20 kg，粉碎，在室溫下95%乙醇冷浸提取3次(25 L×3)，每次浸泡24 h。合并提取液，減壓蒸餾濃縮將乙醇除去，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并得到相應的石油醚相(48.0 g)、乙酸乙酯相(64.0 g)和正丁醇相(58.0 g)。

乙酸乙酯相經(jīng)80～100目硅膠65 g 拌樣，200～300目硅膠290 g裝柱，以石油醚-乙酸乙酯(80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1)進行梯度洗脫，得到4個部分，即Fr.1～Fr.4。Fr.1(21.4 g)用硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯 40∶1)進行洗脫，進一步分為4個組分：Fr.1.1～Fr.1.4。Fr.1.1(460.0 mg)通過反復硅膠柱色譜并結(jié)合Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)以及HPLC半制備(甲醇-水68%)純化得到化合物4(5.0 mg，tR= 17.5 min)、5(2.5 mg，tR= 17.0 min)、7(13.1 mg)和10(6.2 mg)。Fr.1.2(320.0 mg)經(jīng)反復硅膠柱色譜并結(jié)合Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)得到化合物化合物1(5.0 mg)、3(3.1 mg)、8(9.0 mg)、9(4.0 mg)。Fr.1.3(420.0 mg)通過反復硅膠柱色譜并結(jié)合Sephadex LH-20(氯仿-甲醇1∶1)和HPLC半制備(68%甲醇-水)得到化合物2(6.5 mg)、6(9.0 mg，tR= 16.5 min)、11(20.0 mg)。Fr.2(10.8 g)通過硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯20∶1)進行洗脫，進一步得到2個組分，即Fr.2.1和Fr.2.2。化合物14(34.5 mg)經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-丙酮 30∶1)從組分Fr.2.1(5.6 g)中純化得到。Fr.2.2(4.4 g)經(jīng)反復硅膠柱色譜得到化合物12(6.3 mg)和13(7.2 mg)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7使用DMEM培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清和1%青/鏈霉素雙抗溶液)置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 化合物配置及毒性檢測

取適量化合物干燥粉末溶于DMSO溶劑中，配置成濃度為50 mmol/L的母液保存于-20 ℃，使用時用培養(yǎng)基稀釋配置成所需濃度，并保證DMSO終濃度不超過1‰。

將RAW264.7細胞以3×104/孔的密度接種至96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。加入含不同終濃度化合物的培養(yǎng)液處理24 h，同時設(shè)置調(diào)零組和對照組(添加等濃度DMSO)。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液培養(yǎng)4 h后吸去上清并加入150 μL DMSO，避光振搖15 min使其充分溶解，酶標儀490 nm波長檢測吸光度。

細胞存活率 =(OD實驗組-OD調(diào)零組)/(OD對照組-

OD調(diào)零組)×100%

1.2.4 Griess法檢測一氧化氮(NO)

RAW264.7細胞以6×104/孔的密度接種于96孔板，24 h后進行給藥處理，并將細胞分為化合物處理組、模型組、空白對照組。化合物處理組添加所需濃度化合物和終濃度為1 μg/mL的LPS，模型組添加等濃度DMSO和終濃度為1 μg/mL的LPS，空白對照組只添加等濃度DMSO，每組3個復孔，作用24 h后，取上清液加入Griess試劑測定各組一氧化氮(nitricoxide，NO)含量。

NO生成抑制率 =(OD模型組-OD化合物處理組)/

(OD模型組-OD對照組)×100%

1.2.5 ELISA檢測炎癥因子的分泌

RAW264.7細胞以8×105個/孔接種于12孔板，分組處理方式同“1.2.4”。不同濃度的化合物預處理1 h后，加入1 μg/mL的LPS共同作用細胞18 h，收集細胞上清液，使用ELISA試劑盒檢測上清溶液中TNF-α、IL-6 和IL-1β細胞因子的含量。

1.2.6 Western blotting分析

RAW264.7細胞以8×105個/孔接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，分組處理方式同“1.2.4”。不同濃度的化合物預處理1 h，用LPS(1 μg/mL)分別刺激18 h(檢測iNOS、COX-2、STAT3、NLRP-3)和30 min(檢測MAPKs、NF-κB)后，加入裂解液進行細胞裂解。蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，4 ℃封閉1 h，一抗低溫孵育過夜，之后室溫孵育二抗1 h，加入ECL化學發(fā)光試劑，化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)進行顯影。

1.3 統(tǒng)計分析

用SPSS 21.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(Oneway Anova)，圖表中數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤差表示。當P<0.05時，認為具有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)NMR數(shù)據(jù)[12]與文獻報道比對，確定化合物的結(jié)構(gòu)，如圖1所示。

圖1 蜘蛛香中分離得到的化合物1～14的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-14 isolated from Valeriana jatamansi

2.2 化合物體外抑制NO生成結(jié)果

本文利用Griess法檢測NO生成評估了14個化合物的體外抑制NO活性(見表1)，化合物1、2、3、5、8、9對NO的生成具有明顯的抑制作用，IC50分別為0.88、0.62、5.57、18.78、4.07、26.99 μmol/L。根據(jù)實驗結(jié)果我們選擇化合物1和2作為進一步的研究對象。

表1 化合物1～14對RAW264.7細胞的細胞活力及NO生成的影響

2.3 化合物1和2對RAW264.7細胞活力的影響

在測定化合物的抗炎活性之前，首先評估了化合物對細胞活力的影響。如圖2所示，與空白對照組相比，化合物1和2濃度在0.4～3.2 μmol/L時對細胞存活率均無明顯影響。而當化合物2達到6.4 μmol/L濃度時，RAW264.7巨噬細胞活性下降(P<0.05)，在此濃度下化合物1沒有表現(xiàn)出細胞毒性。

圖2 化合物1和2對RAW264.7細胞活力的影響Fig.2 Effect of compounds 1 and 2 on cell viability in RAW264.7 cells注：與模型組對比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note: Compared with model proup,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.4 化合物1和2對NO生成及iNOS、COX-2蛋白表達的影響

當致炎因子如LPS刺激巨噬細胞會導致iNOS的高表達，進而誘導細胞產(chǎn)生大量的NO，同時，還能直接將COX-2催化位點硝基化而促使COX-2的活化[13]。如圖3所示，與空白對照組相比，模型組RAW264.7細胞中NO的生成量顯著增加(P<0.001)；與模型組相比，化合物處理組(0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μmol/L)NO產(chǎn)生量受到明顯抑制(P<0.05)，呈劑量依賴性，IC50分別是0.88和0.62 μmol/L。同時免疫印跡研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組中關(guān)鍵蛋白酶iNOS、COX-2的表達顯著上調(diào)(P<0.001)，確認了炎癥模型成立；而與模型組相比，化合物1和2(0.8、1.6、3.2 μmol/L)處理組iNOS、COX-2的表達均被顯著抑制，并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。

圖3 化合物1和2對LPS誘導的RAW264.7細胞NO生成及iNOS和COX-2蛋白表達的影響Fig.3 Effects of compounds 1 and 2 on NO production,iNOS and COX-2 protein expression in LPS-induced RAW264.7 cells注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。下同。Note: Compared with control,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001; Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.The same below.

2.5 化合物1和2對IL-6、TNF-α分泌的影響

IL-6、TNF-α作為巨噬細胞分泌的重要的炎癥因子，介導多種生物功能，參與對感染、損傷和炎癥的應答。在LPS誘導的RAW264.7炎癥模型中，化合物對炎癥因子IL-6和TNF-α生成的影響是評價其抗炎活性的重要指標。如圖4所示，與空白對照組相比，LPS誘導的巨噬細胞中，IL-6、TNF-α的產(chǎn)生量均顯著升高(P<0.001)；而化合物1和2在0.8～3.2 μmol/L濃度范圍內(nèi)均顯著抑制IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，且呈劑量依賴性。

圖4 化合物1和2對LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6和TNF-α生成量的影響Fig.4 Effects of compounds 1 and 2 on IL-6 and TNF-α production in LPS-induced RAW264.7 cells

2.6 化合物1和2對IL-1β分泌及NLRP3蛋白表達的影響

IL-1是吸引中性粒細胞，促進炎癥介質(zhì)釋放以及引起發(fā)熱的重要炎癥介質(zhì)。炎癥小體NLRP3激活可通過活化caspase-1促進炎癥因子IL-1β的分泌。如圖5所示，LPS刺激導致IL-1β水平顯著升高(P<0.001)，而化合物處理組IL-1β的產(chǎn)生和分泌被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。進一步的，對炎癥小體NLRP3表達的檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LPS處理的細胞模型能顯著誘導NLRP3蛋白的表達(P<0.01)，而化合物1、2處理組NLRP3表達水平顯著降低。提示了化合物對炎癥小體生成的抑制作用。

圖5 化合物1和2對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β分泌和NLRP3蛋白表達的影響Fig.5 Effects of compounds 1 and 2 on IL-1β secretion and NLRP3 protein expression in LPS-induced RAW264.7 cells

2.7 化合物1和2對NF-κB、MAPK信號通路的影響

免疫印跡檢測化合物對LPS誘導的巨噬細胞中蛋白信號通路NF-κB、MAPK的影響。如圖6所示，與空白對照組相比，LPS誘導的模型組能夠顯著上調(diào)細胞IκBα磷酸化水平(P<0.01)，引起NF-κB信號通路的激活；化合物處理組對IκBα磷酸化水平表現(xiàn)出一定程度的抑制作用。同時，LPS刺激顯著上調(diào)了ERK、p38MAPK和JNK的磷酸化水平，不同濃度的化合物處理均對p38MAPK、ERK、JNK的磷酸化和表達沒有明顯影響。

圖6 化合物1和2對LPS誘導的RAW264.7細胞中NF-κB和MAPKs信號通路的影響Fig.6 Effects of compounds 1 and 2 on NF-κB and MAPKs signaling pathways in LPS-induced RAW264.7 cells

2.8 化合物1和2對mTOR/ STAT3通路的的影響

通過免疫印跡實驗進一步檢測化合物對mTOR和STAT3表達和激活的影響。與對照組相比，模型組mTOR和STAT3的磷酸化水平顯著升高，提示該通路在LPS作用下發(fā)生了激活；而各劑量組的化合物1、2處理均可明顯下調(diào)mTOR和STAT3的磷酸化水平(P<0.05)，說明通路的激活受到明顯抑制，且化合物對于STAT3磷酸化的抑制效果更為顯著，如圖7所示。

圖7 化合物1和2對LPS誘導的RAW264.7細胞中STAT3、mTOR表達和磷酸化的影響Fig.7 Effects of compounds 1 and 2 on expression and phosphorylation of STAT3 and mTOR protein in LPS-induced RAW264.7 cells

3 討論

巨噬細胞在免疫及炎癥反應中扮演著至關(guān)重要的角色，在內(nèi)、外界刺激激活時，誘導細胞MAPKs、NF-κB等相關(guān)信號通路的活化，進而調(diào)節(jié)下游的多種炎癥相關(guān)基因的表達，推動級聯(lián)瀑布反應，釋放大量炎癥因子進行防御[14]。而過度的免疫激活往往造成機體損傷，最終導致疾病進一步惡化。

iNOS、COX-2均為誘生型酶，在大多數(shù)組織中不表達或低表達，但在一些炎性細胞因子作用下可呈現(xiàn)高表達。iNOS廣泛參與趨炎因子的表達以及反應性氮化、氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，在炎癥病理發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的一種關(guān)鍵酶，故在炎癥誘導及維持過程中也具有重要作用。以上兩者的表達以及炎癥因子TNF-α和IL-1的產(chǎn)生均受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及STAT3的調(diào)控[15,16]。

非激活狀態(tài)下，NF-κB與阻抑蛋白IκBα在細胞質(zhì)中以復合體形式存在。許多細胞外配體(如TNF-α、IL-1、LPS等)可快速觸發(fā)經(jīng)典的NF-κB信號通路并進一步激活下游激酶，使IκBα發(fā)生磷酸化并進而泛素化降解，游離NF-κB轉(zhuǎn)位入核，激活一系列的促炎靶基因，促進炎癥因子及iNOS、COX-2的表達。STAT3在調(diào)控細胞生長、增殖、分化和凋亡等方面起重要作用，可被多種細胞因子和生長因子激活，如IL-6和EGF/EGFR等，其兩個關(guān)鍵的磷酸化位點705位酪氨酸和727位的絲氨酸，受mTOR、MAPKs、PKC多通路的調(diào)節(jié)。mTOR作為一種參與蛋白和脂質(zhì)合成、自噬、糖酵解和炎癥在內(nèi)的多種生命進程的重要調(diào)控因子[17]，其磷酸化可顯著激活STAT3，而活化的STAT3進一步誘發(fā)下游炎癥基因的表達，釋放IL-6、C3等，進一步反饋刺激STAT3信號通路，形成持續(xù)的炎癥微環(huán)境[18]，是造成炎癥遷延和細胞因子風暴的重要原因。

此外，炎癥小體作為一類胞漿蛋白復合物，是人體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其中NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛的炎癥小體類型。而炎癥小體NLRP3的激活失控可通過活化caspase-1促進炎癥因子IL-1的過量分泌，是造成炎性機體損傷的重要原因之一[19]。

因此，以上介質(zhì)和信號通路均被認為是預防及治療炎癥性疾病[20]的藥物靶點并且相互之間存在著密切的聯(lián)系和協(xié)同作用。本研究對從蜘蛛香中分離獲得的14個環(huán)烯醚萜類化合物進行了抗炎活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物1、2、3、5、8、9具有明顯的抗炎活性，我們重點關(guān)注了巨噬細胞炎癥模型中環(huán)烯醚萜類化合物1和2的負性調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)化合物1、2明顯減輕LPS誘導的炎癥因子NO、IL-1、IL-6及TNF-α的分泌，導致iNOS、COX-2、NLRP3的表達量降低。進一步的實驗研究結(jié)果顯示，化合物1、2處理抑制了LPS刺激的IκBα磷酸化，從而有效的抑制NF-kB信號通路被激活。同時化合物對于mTOR、STAT3磷酸化的抑制進一步減輕了炎癥介質(zhì)的分泌及其后續(xù)產(chǎn)生的反饋作用。

綜上所述，化合物1和2對LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應具有負向調(diào)控作用，其通過下調(diào)NF-κB及mTOR/STAT3信號通路，抑制炎癥小體生成并顯著降低iNOS、COX-2的表達從而調(diào)控NO和各種炎癥因子的釋放，表現(xiàn)出良好的抗炎活性。本研究表明蜘蛛香中以化合物1和2為代表的環(huán)烯醚萜類化合物具有顯著的抗炎活性，很可能是蜘蛛香在傳統(tǒng)用藥中良好抗炎作用的主要活性成分。本研究為蜘蛛香在抗炎方面功效的綜合開發(fā)與利用提供實驗基礎(chǔ)和科學理論依據(jù)。