基于指紋圖譜和化學計量法評價不同產地番石榴葉的質量

李 丹，馮靖雯，陳鴻平，劉友平，胡 媛

成都中醫藥大學西南特色中藥資源國家重點實驗室 中藥標準化教育部重點實驗室，成都 611137

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴(PsidiumguajavaLinn.)的干燥葉，主要分布于廣東、廣西、四川、云南、福建及臺灣[1]等地，具有燥濕健脾，清熱解毒、澀腸止瀉、消炎止血之功效[2-8]。現代研究表明，番石榴葉的主要有效成分包括黃酮類(番石榴苷、異槲皮苷、金絲桃苷、瑞諾苷、萹蓄苷、槲皮素)、三萜類，具有降血糖、抗氧化、抑菌等作用[9-12]。

目前，番石榴葉未被收錄在2020版《中國藥典》，但被《廣西中藥材標準》(1990年版)[4]、《廣東省中藥材標準第一冊》(2004年版)[3]、《湖南省中藥材標準》(2009年版)[6]、湖南省中藥飲片炮制規范(2010版)[8]、《廣西壯藥質量標準》(第二卷 2011年版)[5]、《福建省中藥飲片炮制規范》(2012版)[2]、《四川省中藥飲片炮制規范》(2015年版)[7]收載，是地方標準收載藥材。上述標準僅對番石榴葉中槲皮素進行了定性的薄層鑒定。關于番石榴葉藥材質量方面的研究分析方法主要以大類成分含量及多成分定量為主[13-15]，難以全面反映藥材質量。同時，番石榴作為重要的經濟果木，資源豐富，但產地不一，亦難以控制番石榴葉的質量。綜上，番石榴葉的質量標準和質量評價研究尚不完善，并亟待解決。

中藥指紋圖譜是一種評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優良性和穩定性的綜合、可量化的鑒定手段，現多用于評價中藥材質量[16-19]。課題組前期建立了番石榴葉黃酮類成分一測多評法[20]，為番石榴葉質量控制提供了一定的基礎。本研究以番石榴葉為研究對象，收集了31批不同產地的番石榴葉樣品進行指紋圖譜研究，采用相似度評價、聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析研究番石榴葉質量與產地的相關性，為番石榴葉的質量評價及質量標準研究提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；Agilent 公司)；BN3000型萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；CP2000型十萬分子一電子天平(德國Sartorius公司)；UPTUO-I-1000TE優普系列超純水機(成都純水科技有限公司)；SG8200HDT型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

鞣花酸(批號：CHB190126、成都克洛瑪生物科技有限公司)；金絲桃苷(批號：CHB190107、成都克洛瑪生物科技有限公司)；異槲皮苷(批號：CHB180628，成都克洛瑪生物科技有限公司)；瑞諾苷(批號：CHB200621，成都克洛瑪生物科技有限公司)、番石榴苷(批號：CHB190126，成都克洛瑪生物科技有限公司)；萹蓄苷(批號：CHB180802，成都克洛瑪生物科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA有限公司)；甲醇；無水乙醇( 分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

1.3 藥材

收集不同產地番石榴葉31批，經成都中醫藥大學嚴鑄云教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物番石榴(PsidiumguajavaLinn．)的葉。詳細信息見表1。

表1 不同產地番石榴葉樣品信息

續表1(Continued Tab.1)

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～2 min，5% A；2～15 min，5%→13.5% A；15～40 min，13.5% A；40～65 min，13.5%→21.3% A；65～70 min，21.3%→5% A)；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱定鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷、萹蓄苷對照品適量，加甲醇制成含19.35 μg/mL鞣花酸、82.40 μg/mL金絲桃苷、82.40 μg/mL異槲皮苷、37.60 μg/mL瑞諾苷、75.12 μg/mL番石榴苷、81.52 μg/mL萹蓄苷混合對照品，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定各產地番石榴葉粉末約1.0 g(過四號篩),置于錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL,超聲30 min，濾過，用0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別平行測定6次，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤0.155%，相對峰面積均≤0.255%，表明儀器精密度良好(見表2、3)。

表2 混合對照品共有峰的相對保留時間

表3 混合對照品共有峰的相對峰面積

續表3(Continued Tab.3)

2.4.2 重復性試驗

取樣品S24適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤0.952%，相對峰面積均≤4.732%(見表4、5)。

表4 番石榴葉藥材樣品S24 HPLC圖譜共有峰相對保留時間(重復性)

表5 番石榴葉藥材樣品S24HPLC圖譜共有峰相對峰面積(重復性)

續表5(Continued Tab.5)

2.4.3 穩定性試驗

取樣品S24適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，按“2.1”項下色譜條件，測得各共有峰相對保留時間的RSD均≤1.867%，相對峰面積均≤4.918%(見表6、7)。

表6 番石榴葉藥材樣品S24 HPLC圖譜共有峰相對保留時間(穩定性)

表7 番石榴葉藥材樣品S24HPLC圖譜共有峰相對峰面積(穩定性)

續表7(Continued Tab.7)

2.5 指紋圖譜相似度分析

取不同產地的31批番石榴葉進行指紋圖譜檢測，將結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)，選擇平均數為對照圖譜生成方法進行指紋圖譜相似度分析，在分析檢驗下，以R對照圖譜作為參照圖譜進行相似度計算(見表8)。31批番石榴葉藥材中與R對照指紋圖譜的相似度為0.720～0.928，其中大于0.9有10批，大于0.8有21批。相似度結果表明不同產地番石榴葉指紋圖譜存在差異。31批番石榴葉色譜峰圖見圖1。不同產地番石榴葉的對照指紋圖譜可檢出14個共有峰，通過對照品(見圖2)指認，確定9號峰為鞣花酸，10號峰為金絲桃苷，11號峰為異槲皮苷，12號峰為瑞諾苷，13號峰為番石榴苷，14號峰為萹蓄苷。以峰面積較大、峰形較好且保留時間居中的9號峰作為參照峰，計算其他各共有峰和參照峰的峰面積比值即相對峰面積(見表9)。

表8 番石榴葉指紋圖譜相似度評價結果

續表8(Continued Tab.8)

表9 31批番石榴葉指紋圖譜中共有特征峰的相對峰面積

圖1 31批番石榴葉HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 31 batches of Psidii Guajavae Folium注：9-鞣花酸；10-金絲桃苷；11-異槲皮苷；12-瑞諾苷；13-番石榴苷；14-萹蓄苷(下同)。Note:9-Ellagic acid;10-Hyperoside;11-Isoquercitroside;12-Reynoutrin;13-Guaijaverin;14-Avicularin (the same below).

圖2 混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chart of mixed reference substance

通過相似度對比發現相似度小于0.8的番石榴葉樣品主要產自廣西、廣東，相似度大于0.9的番石榴葉樣品主要產自四川、云南，說明不同產地番石榴葉樣品差異大。通過對比兩類的主要色譜峰峰面積發現產自廣東、廣西番石榴葉樣品中9號峰鞣花酸、10號峰金絲桃苷、11號峰異槲皮苷、12號峰瑞諾苷、13號峰番石榴苷、14號峰萹蓄苷的平均峰面積均小于產自四川、云南的番石榴葉樣品。

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類分析

為全面分析不同產地番石榴葉樣品質量的影響，以14個共有峰峰面積作為變量，運用SPSS20.0軟件對31批番石榴葉樣品進行系統聚類分析，采用組間聯接聚類法，度量標準為Pearson相關性，結果見圖3。31個樣品被分為三大類，3個分類中，四川米易、德昌，云南麗江聚為一類；廣西玉林、南寧、崇左、百色，廣東信宜、廣州、汕頭，海南海口聚為一類；上述2類番石榴葉的地理位置分別相近，各自聚為一類，說明不同產地的番石榴葉藥材可以通過聚類分析對番石榴葉樣品進行分類質量品質評價。

圖3 番石榴葉的系統聚類分析Fig.3 System cluster analysis of Psidii Guajavae Folium

2.6.2 主成分分析及正交偏最小二乘法判別分析

主成分分析法(principal component analysis)是一種通過降維技術把多個變量化為少數幾個主成分(綜合變量)的統計分析方法。這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，它們通常表示為原始變量的某種線性組合。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)是一種有監督的判別分析統計方法，其最大的特點是可以除自變量X中與分類變量Y無關的數據變異，使分類信息主要集中在一個主成分，使模型更簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。

以14個共有峰峰面積為變量，采用SIMCA(14.1)軟件對31批番石榴葉樣品進行PCA，結果提取到2個具有最大特征制得主成分(PC)，總貢獻率為55.1%，其中PC1貢獻率為37.2%，貢獻率最大；PC2貢獻率為17.9%。由前2個主要成分建立坐標系，得到31批番石榴葉的PCA得分圖 (圖4)，由圖4可見，大部分樣品均在95%可信區間，且能分為兩類。其中大部分廣東、廣西、福建、海南番石榴葉樣品聚為一類，四川、云南聚為一類，與聚類分析結果一致。據中國地理分布圖及行政區劃發現四川、云南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山的界限的第二階梯(平均海拔1 000～2 000 m)，屬于西南地區；廣西、廣東、福建海南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山為界限的第三階梯(平均海拔500 m以下)，屬于沿海地區。綜上，2個主要成分能反映不同產地番石榴葉的主要特征，提示沿海地區和西南地區的番石榴葉在化學成分含量上存在差異。

圖4 不同番石榴葉樣品的PCA得分Fig.4 PCA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

依據PCA結果，對不同分布地區的2組樣品進行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2Y(cum)=0.895，Q2(cum)=0.842，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于不同產地樣品的區分。從圖5可以發現，數據的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使兩類樣本完全分開，相互之間沒有樣本出現交叉的情況，少部分樣品在95%可信區間外。

圖5 不同番石榴葉樣品OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA scores of different Psidii Guajavae Folium samples

對OPLS-DA變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)進行分析(見圖6)，VIP值越大的變量(至少大于1)對分類的貢獻越大。采用VIP>1.0作為標準篩選出對模型貢獻較大的變量，分別為峰9、12、11、4、13、3、10，這些成分是引起番石榴葉因產地差異導致成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值<1，對樣品產地區分影響較小。

圖6 番石榴葉14個共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of 14 common peaks of Psidii Guajavae Folium注：1～14：峰1～14。Note:1～14:Peak 1～14.

2.7 多成分含量測定

2.7.1 系統適應性

取混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5(見圖2)。

2.7.2 線性關系考察

精密移取各對照品溶液，至5 mL容量瓶中，加甲醇配制成鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的混合對照品溶液，濃度分別為38.69、164.80、164.80、75.20、150.24 μg/mL，作為標曲最高濃度。精密移取混合對照品溶液1 mL，置2 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋并定容至刻度線，混勻。按照上述方法，依次制備得到不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線及線性回歸方程(見表10)。

表10 線性回歸方程及相關系數

2.7.3 精密度考察

根據“2.4.1”項下精密度考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別為1.51%、1.50%、1.50%、1.51%、1.49%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 重復性考察

根據“2.4.2”項下重復性考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別為2.17%、0.85%、0.90%、2.05%、1.31%，表明該方法重復性良好。

2.7.5 穩定性考察

根據“2.4.3”項下穩定性考察試驗，測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的峰面積RSD值分別1.14%、0.18%、0.36%、0.66%、2.37%，表明該供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.7.6 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的S24番石榴葉藥材6份，每份0.5 g，分別精密加入與樣品中含量相當的鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算各成分的平均加樣回收率，結果鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷平均加樣回收率分別為100.18%、98.17%、97.36%、100.64%、98.40%，RSD值分別為3.50%、2.99%、3.13%、4.29%、2.05%。

2.7.7 樣品含量測定

根據“2.3”項下方法制備番石榴葉藥材供試品溶液，每批平行3份，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄數據。測得鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷的百分含量，具體結果見表11。

表11 31批番石榴葉藥材多成分含量測定結果(n=3)

續表11(Continued Tab.11)

3 討論

參照課題組前期研究[20]，確定提取方法為60%乙醇超聲提取30 min，流動體系為乙腈-0.2%磷酸水，色譜柱(Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。同時，考察波長(230、254、360 nm)及流動體系不同比例梯度洗脫對番石榴葉HPLC指紋圖譜的影響。結果，本試驗確定的色譜條件下，番石榴葉樣品溶液峰數最多，HPLC基線平穩，峰形及分離度較好。

本試驗收集了具有地域代表的番石榴葉藥材，包括廣東、廣西、福建、海南、四川，保證了番石榴葉指紋圖譜的廣泛性。采用相似度評價對番石榴葉HPLC指紋圖譜進行分析，發現31批番石榴葉的HPLC指紋圖譜相似度存在一定差異，不同產地的番石榴葉藥材質量受地域影響。

聚類分析與主成分分析結果一致，發現31批番石榴葉樣品主要分為兩類，廣西、廣東、福建、海南聚為一類，四川、云南聚為一類。根據中國地理分布圖及行政區劃發現四川、云南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山的界限的第二階梯(平均海拔1 000～2 000 m)，屬于西南地區；廣西、廣東、福建海南位于以大興安嶺、太行山脈、巫山及雪峰山為界限的第三階梯(平均海拔500 m以下)，屬于沿海地區。利用正交偏最小二乘判別分析，發現引起此兩類產地番石榴葉差異的7中主要成分，并鑒定出鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷5種成分。通過對番石榴葉樣品中鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮素、瑞諾苷、番石榴苷進行定量分析，發現沿海地區(廣東、廣西、福建、海南)的5種成分含量均低于西南地區(四川、云南)，且有顯著性差異(見圖7)。綜上，番石榴葉的次生代謝產物呈明顯的地域差異，提示番石榴葉的藥材質量與其生長環境密切相關，可能受當地的氣候條件和環境因素影響，其具體影響因素還需進一步調查研究。

圖7 31批不同產地番石榴葉藥材的平均質量分數Fig.7 The average mass fraction of 31 batches of Psidii Guajavae Folium from different origins

本研究以番石榴葉為對象，采用高效液相色譜法，建立了番石榴葉藥材的化學指紋圖譜，測定了番石榴葉藥材中鞣花酸、金絲桃苷、異槲皮苷、瑞諾苷、番石榴苷5種化學成分的含量，并結合化學計量學方法分析了31批不同產地的番石榴葉藥材，發現番石榴葉藥材質量受地域影響。所建立的方法簡便、準確，為番石榴葉藥材的質量控制及質量標準的建立提供了方法及數據參考。