顳下頜關節退行性變早期髁突軟骨細胞行為改變的實驗研究

方苓力 譚璽 葉雨絲 黃蘭 何瑤

重慶醫科大學附屬口腔醫院 口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室 重慶401147

顳下頜關節骨關節炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是一種低炎癥性病變[1-2]，以關節軟骨進行性破壞為主要特征，同時伴有關節盤，滑膜及軟骨下骨的改變[3-4]。

髁突軟骨退行性變則是TMJOA的典型表現，其細胞生物學行為的研究是TMJOA相關研究的重要組成部分。正常情況下髁突軟骨包含4個不同成熟階段的軟骨細胞，從表層向下依次分為纖維軟骨細胞層，多形態細胞層/增殖細胞層，前肥大軟骨細胞層/扁平細胞層，以及最下層的肥大軟骨細胞層[5-7]。作為咀嚼系統的重要組成部分，關節區一定程度的負荷，對維持關節結構和功能的穩態有重要意義[8]。口頜系統的平衡失調，如宿主關節表面適應能力的降低和/或功能性負荷超限，將導致關節區超負荷受載，引起關節軟骨漸進性破壞，促使骨關節炎發生[8-9]。因此，明確超負荷應力下的顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）的反應性改變及TMJOA進展的內在機制，將為后續干預和逆轉TMJOA 病變的發生發展提供重要依據。

目前，建立超負荷應力誘導TMJOA的方式主要是通過增大關節表面的力學加載，打破關節軟骨的改建平衡，從而引起軟骨的退行性改變和軟骨下骨的破壞[10]。強制性張口模型是應用比較成熟的超負荷應力誘導的TMJOA模型。此模型也是為數不多能夠應用于誘導小鼠關節病變的模型，Sobue等[11]發現1 h·d-1，0.5 N的強制張口應力，連續作用5 d后小鼠出現了適應性軟骨細胞增殖，細胞層增厚，基質表達增加的現象[11-12]。Tanaka等[13]使大鼠處于最大開口位1 h·d-1，連續加載20 d出現了軟骨退變晚期的表現，如軟骨層變薄，表層結構破壞，細胞凋亡增加，排列紊亂，基質降解，并伴隨局部細胞巢狀增生[13-14]。此外，結合其他增加應力負荷的造模方式誘導的髁突軟骨退變表現，基本確定了退變初期的適應性增殖階段和晚期以凋亡破壞為主的病損確立階段[15-17]。而對于這2個階段是如何轉變及相關表現，尚缺乏研究探討。因此，本研究應用Sobue等[11]的小鼠建模方法，延長應力作用時間，旨在探索適應性增殖階段之后髁突軟骨退變早期的軟骨細胞生物學行為表現。

除了增殖、凋亡及基質分泌改變這些基本的生物學行為變化以外，近年來研究表明自噬也在骨關節炎進展中發揮重要作用[18]。通過咬合紊亂建立的誘導TMJ退變的模型中發現，在TMJOA病變初期，自噬活性增強，能夠通過去除過量的細胞成分來抑制細胞接觸并阻斷細胞凋亡的誘導，從而減少軟骨細胞凋亡和細胞基質的降解。而在病變晚期，與凋亡相關的蛋白基因激活，自噬活性受到抑制，關節退變加重[19-21]。磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路是被證實在TMJOA的發生過程中起到重要保護作用的一條信號通路，不僅可以通過PI3K的磷酸化實現磷脂酰肌醇3磷酸的轉化，最終使Akt磷酸化而活化，進而參與調控軟骨細胞生長及功能[22]；還可以通過調控下游因子mTOR的活性影響細胞自噬的表達[23]。在手術、氧化應激或基質分解酶誘導的TMJOA發生過程中，該通路被抑制，導致軟骨細胞凋亡增加，軟骨基質合成相關蛋白分泌降低，基質分解酶類表達增高，從而促進了關節軟骨的進行性破壞[24-25]。

因此，本研究通過給小鼠加載適宜的應力，探究在適應性增殖階段之后的髁突軟骨退變早期，軟骨細胞在增殖、凋亡、自噬方面行為的改變以及PI3K/Akt信號通路的表達變化，以期加深對于TMJ退行性變進展的認識，進而為早期干預治療TMJOA提供相應參考靶點。

1 材料和方法

1.1 動物模型構建

8周齡C57BL/6野生型雄鼠，購自重慶醫科大學動物實驗中心，隨機分成2組，每組5只。實驗通過重慶醫科大學附屬口腔醫院倫理委員會審查［批號：2020年倫審（004）號］。根據Sobue等[11]描述的強制張口模型建模，誘導麻醉后固定。實驗組清醒時放置開口器，產生0.5 N強制張口力壓迫TMJ，1 h·d-1（圖1A）。對照組僅固定，10 d后取樣。處死前1天腹腔注射5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）試劑A（廣州銳博生物科技有限公司）50 mg·kg-1，0.1 mL·g-1體質量（圖1B）。

1.2 樣本收集

過量水合氯醛處死小鼠，正中矢狀面剖開頭部。右側分離出完整下頜骨，擬行激光共聚焦掃描及EdU染色。左側頭部固定后脫鈣、脫水、修剪后冠狀向包埋標本，制成5 μm厚度石蠟切片行后續染色。

圖 1 應力刺激下TMJ軟骨的組織形態學表現Fig 1 Histomorphology of TMJ cartilage stimulated by stress

1.3 石蠟切片染色

常規進行蘇木精伊紅（hematoxylin and eosin，HE）和甲苯胺藍染色。切片于室溫脫蠟、水化，抗原修復15 min，3%過氧化氫孵育10 min，山羊血清封閉20 min，滴加體積分數為1∶100的一抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、體積分數為1∶100的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-requiring aspartate protease3，caspase3）、體積分數為1∶200的自噬基因Beclin1、體積分數為1∶100的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（phosphorylated Akt，p-Akt）（成都正能生物技術有限責任公司），體積分數為1∶100的Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ，Col Ⅱ）、體積分數為1∶100的基質金 屬 蛋 白 酶 13 （matrix metalloproteinase 13，MMP13）（北京博奧森生物技術有限公司），體積分數為1∶100的蛋白聚糖（aggrecan，Acan）（武漢三鷹生物技術有限公司），體積分數為1∶100的微管相關蛋白1輕鏈3（light chain 3，LC3）、體積分數為1∶50的磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamyoin， p-mTOR）（Abcam Plc公司，美國），4 ℃孵育過夜；山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）孵育30 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）（北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色，蘇木素（北京百靈威科技有限公司）復染，脫水，透明，封片。

光學顯微鏡（中國奧林巴斯有限公司）下觀察，采用Image-ProPlus6.0圖像分析系統（Media Cybernetics圖像技術公司，美國），每張切片截取關節軟骨內、中、外側3個部位12×8 cm2面積大小進行積分光密度（integralopticaldensity，IOD）統計。

1.4 髁突軟骨激光共聚焦掃描及重建

下頜骨固定后加入10 μg·mL-1的4，6-二氨基-2-苯基吲哚（重慶蒙博生物科技有限公司）500 μL避光孵育24 h，掃描軟骨中段，設置同課題組前期研究[26]，掃描通道405 nm，掃描深度60 μm，層距2 μm。Leica Application Suite X軟件三維重建，觀察髁突軟骨內細胞分布。

1.5 關節軟骨冰凍切片EdU染色

右側下頜骨脫鈣，蔗糖梯度脫水后包埋，8 μm切片。根據EdU試劑盒（C10301，廣州銳博生物科技有限公司）染色，固定后滴加2 mg·mL-1的甘氨酸（重慶蒙博生物科技有限公司）1 mL作用10 min，1 mL 0.5%曲拉通（Sigma公司，美國）穿透10 min，Apollo染色反應液孵育30 min，0.5%曲拉通洗3次，10 μg·mL-14，6-二氨基-2-苯基吲哚1 mL復染，激光共聚焦顯微鏡405 nm和643 nm通道掃描。以7×10 cm2統計陽性細胞數。

2 結果

2.1 TMJ軟骨的組織形態學改變

HE染色結果顯示：實驗組軟骨結構完整，細胞層增厚，軟骨細胞排列紊亂，總細胞數目減少，內側細胞減少更明顯，但并未出現典型的巢狀增生表現（圖1C～F）。甲苯胺藍染色提示：實驗組較對照組軟骨基質減少（圖1G～H）。共聚焦掃描重建顯示：實驗組細胞排列紊亂，密度降低，局部區域細胞減少明顯（圖1I～J）。結合適應性增殖階段和退變后期軟骨的表現，認為該期處于軟骨退變早期即適應性增殖后的過渡階段。

2.2 顳下頜關節軟骨細胞的基質蛋白表達

Acan和Col Ⅱ是鑒定軟骨基質蛋白的主要標記物，實驗組Acan明顯較對照組減少，其IOD值也降低（圖2A～C）。Col Ⅱ在增殖層和前肥大軟骨細胞層中表達較對照組有所增加，在肥大軟骨細胞層中Col Ⅱ的表達則較對照組減少，但總的IOD測量值實驗組比對照組低（圖2D～F）。MMP13是主要的基質金屬蛋白降解酶，實驗組的表達明顯增加（圖2G～I）。結合以上變化，說明實驗組經應力誘導后軟骨基質出現降解。

圖 2 TMJ軟骨的基質表達變化Fig 2 Expression of TMJ cartilage matrix

2.3 顳下頜關節軟骨細胞的增殖和凋亡

活體增殖細胞標記結合EdU染色能較準確的反應細胞增殖狀態[26]，陽性細胞核呈紅色，實驗組多于對照組（圖3A～C）。PCNA也是增殖細胞的常用標記蛋白，實驗組陽性細胞的百分率多于對照組，且實驗組中可見個別肥大軟骨細胞細胞核呈陽性表現，IOD值也大于對照組（圖3D～F）。細胞凋亡的主要蛋白酶caspase 3在實驗組中陽性表達增加，IOD值也較對照組大（圖3G～I）。因此，應力作用下軟骨細胞增殖和凋亡活性都較對照組增強。

圖 3 TMJ軟骨細胞在應力作用下的增殖與凋亡表現Fig 3 Proliferation and apoptosis of TMJ cartilage under stress stimulation

2.4 TMJ軟骨細胞自噬水平

作為自噬的重要標志性蛋白，Beclin1和LC3是自噬體形成的標志，代表其活化的強度。實驗組Beclin1和LC3表達較對照組升高，相應的IOD值也增大（圖4），說明在應力作用后的髁突軟骨自噬表達增強。

2.5 TMJ軟骨中PI3K/Akt通路的變化

在對PI3K/Akt通路關鍵激活因子檢測中發現，實驗組p-Akt的表達較對照組明顯升高，其IOD測量值也增大（圖5A～C）。mTOR作為PI3K/Akt通路的下游關鍵因子，實驗組表達高于對照組（圖5D～F）。由此推測應力誘導的髁突軟骨退變過程中，伴隨PI3K/Akt信號通路的激活。

3 討論

過大的機械應力是TMJOA發生的重要病因。目前，應力導致TMJOA的模型主要有咬合紊亂模型、強制張口模型、根據飲食硬度改變咀嚼負荷模型等。相較而言，強制張口模型操作可人為量化，一致性好。

Sobue等[11]連續5 d加力1 h·d-1后，小鼠關節出現軟骨層增厚，細胞增殖增加等初期表現。而學者們[13-14]加大應力后，大鼠髁突軟骨出現典型的確立期表現。目前尚未發現有對TMJ在病變初期到病變確立期這個過渡期關節軟骨退變行為表現進行探索的實驗。因此，參考Sobue等[11]的實驗結果，加力10 d觀察到小鼠髁突軟骨在細胞層增厚的基礎上，出現細胞排列紊亂，數目減少，基質降解的情況，但并沒有典型的巢狀增生表現，軟骨結構保持完整。Utreja等[12]采用與Sobue等[11]一樣的加力方式和時間，利用轉基因小鼠標記各層軟骨細胞，發現應力加載后軟骨各層厚度均增加，伴隨EdU標記細胞的增加。Utreja等[12]認為在應力作用下細胞軟骨層厚度的增加不僅是軟骨細胞增殖增加的結果，也可能是髁突軟骨中前肥大軟骨細胞分化水平增加，從而促進了軟骨細胞層增厚。本實驗結果顯示軟骨細胞層厚度增加，但軟骨細胞數目減少。結合本研究實驗組較對照組EdU和PCNA表達增加的結果，筆者猜測一方面可能是由于軟骨細胞在加力前期階段出現了適應性細胞增殖，軟骨層呈增厚的狀態，但由于應力持續作用，軟骨破壞發生，導致軟骨上層及表層細胞數目首先減少，而肥大軟骨層的細胞數目還尚未表現出明顯減少[27]，故而軟骨細胞層厚度仍保持較厚狀態。此外，MMP13作為軟骨細胞分化的重要標志物，在本實驗中部分前肥大軟骨細胞呈陽性表達，因此另一方面也不排除在應力加載后前肥大軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化加劇，進而引起軟骨細胞層增厚的可能。

圖 4 應力作用下髁突軟骨細胞中自噬的表達Fig 4 Expression of autophagy in condylar chondrocytes under stress stimulation

圖 5 p-Akt及p-mTOR在應力誘導的TMJ軟骨中的表達Fig 5 Expression of p-Akt and p-mTOR in stress-induced TMJ cartilage

近年來，有學者[12,28-29]認為部分分化后的肥大軟骨細胞仍保持增殖能力。Kurio等[5]在幼鼠和3個月大的小鼠中用EdU進行增殖細胞示蹤，顯示EdU標記的軟骨前體細胞可向軟骨細胞和肥大軟骨細胞進行分化和遷移，且分化后的肥大軟骨細胞EdU仍呈陽性表達。本研究的結果也顯示實驗組中PCNA在部分肥大軟骨細胞核中呈陽性表達，說明此部分肥大軟骨細胞在分化后仍具有增殖潛力。

在OA發生的過程中，自噬水平也會發生相應變化。Zhang等[21]發現，咬合紊亂導致的應力作用初期軟骨細胞排列不規則，軟骨層出現無細胞區域，LC3、Beclin1以及溶酶體的表達水平升高，電鏡下觀察到自噬小體的形成，表明自噬活性增強。此外，Yang等[19]也證實了在TMJ早期病變時，細胞自噬和凋亡都被激活，而晚期自噬體與溶酶體的融合過程受阻，自噬活性受到抑制，TMJ病變進一步加重。結合本實驗結果，筆者發現在應力誘導的TMJ退變早期，軟骨細胞為了對抗應力刺激進行了代償從而引起自噬的活化。

PI3K/Akt通路參與調控軟骨細胞生長發育及生物學行為表現已被眾多實驗證實[30]。研究[31-32]表明，PI3K/Akt通路促進軟骨細胞存活和基質合成。Zhang等[33]發現，一定的壓力刺激促進軟骨細胞增殖，伴隨PI3K/Akt通路激活。此外該通路還影響自噬表達。Xiao等[34]通過抑制PI3K/Akt和mTOR的活性增強了對軟骨細胞的保護作用。對于本實驗PI3K/Akt和mTOR活性增強，自噬表達增加的結果，提示自噬活性調控可能不僅是PI3K/Akt單獨作用的結果。有學者[35]發現，Beclin 1蛋白可以通過與其他因子相互作用來調節細胞自噬水平。Arai等[36]在Beclin 1基因敲除鼠中發現，軟骨細胞分化功能受損，軟骨基質表達減少。此外，Yang等[37]發現，激活p53可以抑制軟骨細胞的自噬表達，促進軟骨細胞凋亡。因此，對于應力誘導下髁突軟骨自噬的具體調控機制還需要更深入的實驗研究。Shanware等[38]將PI3K信號級聯、中間代謝和自噬合稱為新陳代謝的超級信號網絡，其中一個部分障礙會有其他部分的補償響應。在本實驗中應力誘導TMJ退變早期軟骨細胞的一系列反應可能也與此有關，具體的調控機制尚需進一步研究明確。

目前，臨床上關節疾病的分期主要依據臨床體征和影像學檢測結果。但相較之下病理學指標更加敏感，能在關節軟骨退變早期即體現出細胞和分子表達的改變。而當病理學上軟骨退變后期出現比如關節軟骨裂隙和吸收等嚴重表現時，影像檢查才可見部分現象，此時依據影像學表現的臨床分期，事實上已經錯過了關節軟骨退變的早期階段，并不利于TMJ治療的早期干預和治療。而依據臨床體征進行的分期，由于個體差異較大，和病理學表現建立聯系相對更困難。因此如何將關節病變的病理學表現與臨床檢測相結合，還需要進一步研究探索。一方面，可以通過更精細的影像技術與關節軟骨退變的病理改變相關聯[39-40]。另一方面，也可以考慮采集體液樣本檢測關鍵指標來建立與關節軟骨退變病理學表現的聯系[41]。

綜上所述，退變早期髁突軟骨可能仍處于細胞增殖與凋亡的抗衡狀態，表現為軟骨細胞增殖、凋亡及自噬生物學行為均有一定程度的激活，并伴隨PI3K/Akt通路表達活化。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。