引導組織/骨再生牙周功能梯度膜的研究進展

趙文俊 陳宇

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院病理科 成都 610041

功能梯度材料（functionally gradient materials，FGMs）是20世紀80年代末由日本學者提出的材料制造的新概念，主要應用于工業[1]。近年來，隨著材料科學和生命科學的不斷進步，出現了將FGMs應用于生物醫學領域的新發展。材料功能梯度化是材料發展的重要方向，指一種或多種復合材料組成的，在組成或結構等方面呈連續或梯度變化的新型材料，能滿足在極限環境下正常工作的需求[2]。它的設計制造基于性能隨材料內部位置的變化而變化，使材料的整體性能得以提升。該材料所展現的優良性能不僅受到工業界、材料界的高度重視，而且在生物醫學領域也有初步的應用并展現了廣闊的前景，如鈦種植體的表面涂層、人工心臟瓣膜、人工關節及骨連接體等[3]。

牙周炎、創傷及腫瘤常常導致牙周組織缺損[4]。引導組織再生（guided tissue regeneration，GTR）是修復牙周組織缺損的有效方法，已被廣泛應用于臨床，其原理是將具有適當形狀物理屏障膜放置于特定缺損位置，以覆蓋再生過程所在的區域；膜將上皮和牙齦結締組織細胞從缺損區域中隔離，在下方形成相對封閉的空間，并引導牙周干細胞優先定植在暴露的牙根表面，促進牙骨質、牙周膜及牙槽骨的生長，以實現牙周組織再生的目標。目前，GTR代表了獲得牙周組織再生的最佳方法，能有效促進新的牙周組織和骨質的形成。隨著種植修復廣泛開展，將GTR技術用于種植體周圍骨缺損的修復稱為引導骨再生（guided bone regeneration，GBR）。GTR/GBR技術中的關鍵環節就是生物屏障膜（biological barrier membrane，BBM） 的運用[5-6]。作為物理屏障，BBM主要作用是阻擋牙齦結締組織和上皮向缺損處生長，提供并維持相應成骨空間，為牙周組織的再生及種植體周圍骨缺損的修復創造一個相對密閉的有利空間。

然而，越來越多的細胞和分子學研究[6-7]表明，在GTR/GBR過程中，BBM不僅僅是被動屏障，更是生物活性空間，應有意識地調整膜的組成和結構以增強GTR/GBR。目前，基于FGMs理念，用分級結構生物材料制作方法所構建的用于牙周GTR/GBR的膜——功能梯度膜（functionally gradient membrane，FGM），將是一種空間維持、功能分級和生物活性的生物材料，結合納米技術及搭載多種生物活性藥物和因子，能使膜更好模擬細胞和組織微環境，促進細胞的黏附、增殖和所期望的方向分化，達到優異的仿生效果，從而促進牙周再生[8-12]。

1 牙周FGM的設計要求

理想的GTR/GBR膜應具備以下特點[13-14]：有一定的柔韌性，易于植入手術操作；良好的生物相容性，降解產物無毒性作用，不干擾組織的再生；有一定的機械強度，維持組織再生所需的空間；降解速率可控性，降解時間與組織再生過程相協調（對于GTR至少在4～6周內保持5～8 MPa的強度，對于GBR應保持24周以上）；具有良好的細胞及組織親和性，選擇性的引導組織細胞再生及定向分化。

然而，目前的膜均未達到“理想”的要求。目前運用于臨床的商業化膜主要有第1代不可吸收膜（如聚四氟乙烯膜）和第二代可吸收膜（如膠原膜、人工或天然聚合物膜）[14-15]。第1代生物膜性能優異，但需要二次手術取出，干擾了新生牙周組織的形成和增加患者的痛苦；目前的可吸收膜具有易降解及生物活性不強等許多結構、機械和生物功能的限制，不能滿足牙周再生治療的需求。

FGM制作基本原理是設計一種膜，可以定制不同層的特性，使膜能保持足夠長時間的結構、尺寸和機械完整性，以促進組織再生[16]。作為界面植入物，GTR/GBR膜的外側與牙齦結締組織及上皮接觸，內側與牙周膜細胞及牙槽骨組織接觸。為了實現良好的牙周再生，臨床期望膜的多方面性能得到提升，主要為：外側面能促進軟組織生長愈合，并能阻止口腔細菌的定植；與骨組織及牙周膜接觸的內側面具有良好的促成骨能力，誘導牙周膜細胞及前成骨細胞的成骨向分化；在實現良好生物功能的同時能夠維持一定時間的機械強度，為下方的組織再生維持良好的空間，在完成組織再生前不隨著膜的降解而變形坍塌。

基于牙周GTR/GBR的原理及FGM的制造理念，學者們[16]設想將這種界面植入物設計成具有成分和結構呈梯度或連續變化的結構（圖1），促進骨生長、防止口腔細菌浸潤及牙齦組織向下方組織缺損區生長，使膜的特性愈趨于“理想”，以滿足局部功能要求，使膜多方面性能得以提升，實現更優良的組織再生。

2 FGM的種類及其分層形式

2.1 經典多層形式

Bottino等[17-18]設計了具代表性的一種新型多層FGM，通過靜電紡絲制備，包括3部分，共5層（圖2）：分別是核心層（core layer，CL）和2個具有生物特異功能的表層。1）CL：其主要作用為維持膜的力學強度，抵抗外來應力，為了牙周組織再生創造一個相對穩定、密閉的空間。為了和功能性表層形成逐漸過渡，將CL進一步細化成3層結構；2）表層：表層主要的作用是發揮特定的功能作用，面向牙齦軟組織側的表層可促進軟組織的再生愈合，防止口腔微生物的定植；面向骨缺損的表層可誘導相對封閉缺損區的干細胞等成骨向分化，促進新附著及新骨的形成。

CL和具有特定生物功能的表層，形成化學組成及機械性能呈階梯變化的一個整體結構。從中心向表層，生物學性能逐漸增強，而力學強度逐漸下降；然而，從表層向中心，力學強度逐漸增強，而特異的生物學性能逐漸下降[17]。FGM具有將諸多所期望的性能集于一體的優良設計，為更優異的功能性GTR/GBR膜的開發提供了新的思路和方向。

圖 1 FGM呈階梯或連續變化示意圖Fig 1 Diagram of FGM showing ladder or continuous change

圖 2 Bottino MC設計的FGM結構示意圖Fig 2 FGM structure diagram designed by Bottino MC

2.2 三層膜

三層膜結構雖然并不完全符合FGM的要求，但其制作相對簡單，設計也體現了FGM的部分特征。Teng等[19]采用溶劑澆鑄法和蒸發法制備了不同比例的納米羥磷灰石/殼聚糖（nano hydroxyapatite/chitosan，n-HAp/CS）復合膜，3層結構膜的頂層和底層均由含20%羥磷灰石（hydroxyapatite，HAp）的膠原組成，中間層由CS組成。Ku等[20]制備了CS和聚乳酸（polylactic acid，PLLA）組成的3層膜，該膜由2個CS網狀外層和1個PLLA納米多孔中間層組成，CS纖維網的外層具有高度的生物相容性和粗糙的表面，便于細胞黏附，PLLA層旨在為防止上皮細胞侵襲，體外降解和細胞學實驗結果表明CS/PLLA膜具有良好的生物相容性和機械穩定性（膜保持其完整性長達8周）。

2.3 變異形式

在經典的FGM出現以前，學者們合成了大量的雙層、不對稱性膜等結構，這些形式可視為FGM的前體或變異形式，其構造理念在功能和作用上已經逐步向FGM靠近。Bio-Gide膜為臨床最常用的商品化膠原膜，由豬的Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維組成的，為雙層結構，外層致密光滑和內層呈多孔；當用于GBR時，多孔層可以使成骨細胞遷移，促進骨生長，同時致密層可以防止成纖維細胞侵入；據觀察，Bio-Gide膜可迅速吸附自體骨碎片釋放的生長因子，有助于GBR[14]。有學者[21]用靜電紡絲法制備雙層生物活性膜，其中1層使用聚癸二酸甘油酯/聚己內酯/β-磷酸三鈣（polygly-col sebacate/polycaprolactone/β-tricalcium phosphate，PGS/PCL/β-TCP）制備生物活性層提供GBR，另一側使用PGS/PCL/CS三元混合物紡絲層來促進牙周的愈合。Ma等[22]利用液氮淬火和冷凍干燥相結合的方法來制備不對稱CS膜，并用三聚磷酸鈉進行交聯，交聯可使膜的一側較另一側更加致密，得到雙側密度不對稱的膜，同時膜的力學性能也得到加強。

3 合成方法

梯度功能的材料制作理念首先產生并較早的應用于機械工程領域，合成方法種類繁多，有電鍍和電泳法、電鑄法、化學鍍法、粉末冶金等方法。由于生物醫學領域的生物相容性、生物安全性等特殊要求，其對原材和制備方法的要求與工程領域有所差異。FGM常有以下合成方法，也有多種方法的復合。

3.1 靜電紡絲

靜電紡絲的纖維可達到納米水平，廣泛應用在組織工程及再生組織領域[23]。Bottino等[18]采用靜電紡絲法逐層堆疊制備的FGM。CL由3層組成，包含1個純聚D，L-乳酸-co-己內酯PLCL層［poly（D,L-lactic acid co caprolactone），PLCL］ 以及由明膠、PLCL和PLA混合物組成的2個復合層包圍。PLCL具有特殊的彈性，使膜有利于折疊、裁剪和縫合等，這是膜能夠在體內植入的關鍵環節。CL主要承擔著FGM在體內的機械性能的，可根據其預測膜在體內的降解時的機械性能變化。在水化條件下，CL表現出較高的拉伸強度（8.7 MPa）和拉伸模量（156 MPa），破壞應變為375%。未觀察到膜分層，預示在生理條件下，分級結構保持完整。2層富含蛋白質復合層的加入降低了膜的拉伸性能，拉伸強度為3.5 MPa，拉伸模量為80 MPa，斷裂應變為297%。功能表面層包含內、外表面層，內側骨界面，包含n-HAp；外側上皮界面，包含甲硝唑（metronidazole，MET）。

3.2 溶液澆鑄

有學者[23-24]制備的三層膜，由聚乳酸-co-乙醇酸 ［poly（lactic acid co glycolic acid），PLGA］、納米碳酸羥磷灰石（nano hydroxyapatite carbonate，nCHA）和膠原組成，即：nCHAC/PLGA，通過逐層澆鑄法，分別為內側8% nCHAC/ PLGA，中間層PLGA/4% nCHAC 和外側PLGA，內側多孔側允許細胞黏附，外側PLGA層為光滑無孔，阻止細胞黏附。還有學者[25-27]采用溶液澆鑄并結合熱誘導相分離及溶劑浸出技術，制備了由不同比例PLGA/n-HAp/月桂酸（lauric acid，LA）組成的3層復合膜，LA為長鏈飽和脂肪酸，具有抗菌作用，采用熱誘導相分離工藝可調整、平衡膜的機械性能（硬度和彈性），使膜的機械強度增強，抗拉強度從1.54 MPa上升到2.27 MPa以上。 Leal等[28]通過調整溶液澆鑄法制備膜，促進無機組分生物玻璃（bioglass，BG）沿膜厚度不均勻分布，復合膜的BG富集面能更多的誘導磷酸鹽緩沖液中骨樣磷灰石沉淀，表明這種生物膜具有不對稱的骨傳導特性。

3.3 其他方法

制作生物醫學功能梯度材料的其他方法有離心法、混合、激光加工、放電等離子燒結、控制鹽晶體作為成孔劑的比例、3D打印、熔融沉積法等[2]。Almasi等[29]首次采用電泳技術來控制四環素（tetracycline，TCH）在PLA溶液中的分布，待溶劑揮發后成膜，結果表明，利用電泳力，可以使更多的TCH在薄膜頂面聚集，從頂面向底面濃度依次降低，形成濃度梯度，同時，抑菌實驗表明，TCH含量較高的薄膜樣品表面的對大腸桿菌的生長有更好的抑制作用。也可以使用2種或2種以上的方法復合。有學者[30]用PLGA制作雙層膜，采用澆鑄法制備了致密層，然后用氣紡在其表面制備疏松的纖維層；致密層防止上皮組織長入，疏松纖維層支持細胞定植和骨再生，維持屏障功能達16周，動物實驗顯示了比膠原膜更好的成骨性能。學者們[31-32]應用功能梯度這個理念，設計FGM的不同層，這些膜可以組合在一起成為整體，作為GTR膜，他們使用了冷凍凝膠和靜電紡絲技術，并對各層進行了完整的表征，并建議將其用于功能梯度結構。

4 FGM改性方向

4.1 仿生學改性

仿生是再生領域的重要研究方向，梯度性質的生物聚合物材料能在形態、結構、組成等方面模擬天然細胞外基質、細胞和組織微環境，更有利于組織再生[8]。體外研究表明[33-36]：膜的表面形貌、化學成分和孔隙結構可影響多種細胞的增殖。研究[34]發現，納米形貌影響細胞黏附、遷移、增殖和分化等生物行為，取向排列的纖維形態導致細胞形態方向高度一致。由生物相容性和可降解的天然或合成材料組成的聚合物或混合物，通過靜電紡絲所產生的納米級至亞微米級纖維膜，類似于天然細胞外基質的組成和排列方式[31]。

4.2 抗菌改性

抗菌性能是GTR/GBR中有必要加強的環節，炎癥刺激會影響新組織的生長，GBR失敗常源于膜暴露于口腔時細菌污染所導致[4-5]。控制或減少牙周缺損處病原微生物對促進牙周再生至關重要。口服抗生素作為牙周病的輔助治療藥物，有助于減少或消除牙周病原體，為防止耐藥性等問題，研究人員設計了能夠控制和局部輸送藥物的膜材料[37-39]。

Bottino等[18]設計的FGM中，將25%MET加入到上皮組織側的界面層中，即PLA/明膠/25%MET。將TCH通過共混或同軸靜電紡絲結合到PLLA纖維中，通過體外釋藥評價表明，由核-殼纖維加工而成的纖維比混合纖維具有較低的早期突釋和更持續的釋放，這對于避免細菌感染具有重要價值[39-40]。一種新開發的納米銀-羥磷灰石-鈦/聚酰胺 （nano silver hydroxyapatite titanium/polyamide，nAg-HAp-TiO2/PA）納米復合材料的GBR膜，nAg具有抗菌作用，此膜比膨體聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene，e-PTFE）膜具有更高的堿性磷酸酶水平，更高的成骨活性，在體內8周后，nAg-HAp-TiO2/PA和e-PTFE組均出現骨缺損的完全閉合[41]。Chou等[42]報道了2種市場銷售的可生物降解膜，即Resolut Adapt LT（一種聚酯基膜）和Bio-Mend Extend（一種Ⅰ型牛膠原蛋白）經磷酸鋅礦化后的抗菌效果，發現與未礦化膜相比，磷酸鋅礦化導致伴放線放線桿菌活性顯著降低。

4.3 促成骨改性

成功的牙周再生有賴于材料與其他因素如生長因子、細胞和血液供應之間的精確相互作用[17]。目前，骨移植材料、外源性生長因子和細胞為基礎的治療方法的應用已經促進了GTR/GBR[43-44]。局部提供多種生長因子，如富含血小板的血漿（platelet rich plasma，PRP） 和骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），通過調節細胞活性和刺激細胞分化來合成細胞外基質以形成新組織，從而促進牙周愈合和再生。

骨移植材料如n-HAp、β-TCP、BG等，有良好的骨傳導性和骨誘導性，已被公認為是骨組織構建的關鍵成分，在開孔骨支架中，通過吸引骨細胞遷移來實現組織滲透，從而使支架具有更好的生物整合性[45-47]。許多學者[46-47]研究了n-HAp顆粒在體外對骨組織再生的影響。Liao等[24]發現，n-HAp的加入提高了膜的生物相容性和骨傳導性。Yang等[46]制作的靜電紡絲膜由n-HAp和PCL組成，這證實n-HAp的摻入在提高膜生物活性和促進早期細胞分化，使細胞具有更好的黏附和增殖能力，可增強膠原與聚合物的共靜電紡絲膜的機械性能。

5 總結與展望

基于先進的設計理念，FGM能形成理化性能、結構、生物性能的連續或梯度結構，不僅更好地將材料各組分的性能得以展現，同時能搭載更多的因子或成分，并結合納米技術、靜電紡絲等技術，多方面提升和優化材料的整體性能，將仿生組織工程技術推向更高的地位，極大限度地促進GTR/GBR。然而，FGM還有以下方面有待進一步發展和改進：1）需要較復雜的制作工藝和設備，限制了其較大規模的生產和應用；2）其性質不同于簡單組分和結構的材料，尚未有成體系的評價標準；3）其內部各組分和結構的相互影響，一定程度上增加了其性質的多變性。

總之，目前FGM僅以少量變異的形式應用于臨床，有一些有待改進和發展的方面，但比結構功能單一的傳統膜更具有明顯的優勢，有望對GTR/GBR產生重要的促進作用，有更大的臨床應用前景。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。