乳及乳制品中抗生素殘留檢測研究進展

王雪晴,郝愛月,譚新柳,張立慧,梅艷珍,戴傳超,明燈明,黃 菲,楊雅瓊

(1.南京工業大學 藥學院,江蘇 南京 211800;2.南京師范大學 生命科學學院,江蘇 南京 210046;3.南京師范大學 食品與制藥工程學院,江蘇 南京 210046)

牛奶因其營養豐富,易于消化,便于食用,而成為人類理想的天然食品。常喝牛奶有助于身體的發育,補足鈣質需求量,減少骨骼萎縮,降低骨質疏松癥的發生概率。然而,隨著乳及乳制品行業的快速發展,抗生素被大量應用于畜牧業中,其根本目的是為了保障動物的健康以及畜牧業的經濟效益,但也不可避免地造成了乳制品中抗生素的殘留[1]。乳與乳制品中抗生素的種類主要包括:四環素類、β-內酰胺類以及氨基糖苷類等,因其可以有效預防和治療人類和動物的傳染病,而在人類醫學和畜牧業中受到極大關注,被廣泛用作食品添加劑以及治療畜牧業中的細菌感染性疾病。牛奶中的抗生素殘留是全世界奶牛業普遍存在的問題,這是因為奶牛場均用抗生素類藥物治療奶牛疾病,如奶牛的乳腺炎、子宮內膜炎或其他炎癥性疾病。據調查,在我國臨床型奶牛乳腺炎發病率占牛乳腺炎總發病率的21%～23%[2]。

奶牛在飼養過程中會經常性地感染大量有害病菌。例如:乳牛食入了被農藥或放射性物質污染的飼料和水。而飼養牛奶的農戶為促進牛體正常生長并且要治療疾病,就會通過注射或者飼喂等方式對乳牛使用一些激素和抗生素。這些激素、抗生素、放射性物質和農藥就會通過牛機體而進入牛乳中,對牛乳造成污染。除此之外,為了保證新鮮獲取的牛乳不被細菌污染,也會在牛乳中加入抗生素來抗菌,這些都是牛乳中可能存在抗生素殘留的原因。Vieira等[3]的實驗證明：即使牛乳中含有微量的抗生素,也可導致人體對抗生素產生過敏或增加抗藥性,因此對大眾健康有害,同時影響發酵乳制品的生產。為此,了解乳與乳制品抗生素殘留的來源、類別以及危害,實現乳與乳制品中抗生素殘留檢測成為當前食品安全檢測的當務之急。

1 乳及乳制品中殘留的抗生素

幾十年來,抗生素藥物特別是四環素類、β-內酰胺類和氨基糖苷類抗生素是乳與乳制品中抗生素殘留的主要類別[4]。

四環素類藥物屬于一個抗生素大家族,它的首批成員來自放線菌的鏈霉菌屬。1944年從金色鏈霉菌中分離出金霉素,幾年后,分別從龜裂鏈霉菌和金霉素鏈霉菌中分離出土霉素和地美環素,金霉素氫解后生成四環素[5]。20世紀60年代初,人們開發出了多西環素,它是土霉素的半合成衍生物[5]，2005年又合成出替加環素。這一類廣譜抗生素,能抑制蛋白質合成,使藥物可逆地與敏感菌的核糖體30S亞基結合,阻礙氨基酰tRNA與mRNA-核糖體復合體上的受體結合,阻止氨基酸增加到肽鏈上[6]，且對四環素類呈抑菌活性,但是對敏感菌具有殺滅作用[6]。

β-內酰胺類抗生素包括青霉素族和頭孢菌素族,這類藥物都具有殺菌活性,主要通過干擾細菌繁殖過程中肽聚糖的合成來發揮效果[7]。β-內酰胺類抗生素主要通過共價鍵與細菌細胞壁上的青霉素結合成蛋白(PBP),PBP是一種胞壁粘肽合成酶, 可以使肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸-N-乙酰葡糖胺骨干上肽鏈之間交叉連接。當抗生素與PBP結合后,細菌細胞壁合成因缺乏交叉連接,細胞壁形成受阻,從而導致生長細胞裂解[8]。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對β-內酰胺類的敏感性差異是由于后者細胞壁上肽聚糖的含量較高,二者含有青霉素結合蛋白的量不同,使得某些β-內酰胺類很難滲透穿過革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖層[9]。

氨基糖苷類抗生素分為天然和半合成兩大類,天然來源的包括由鏈霉菌屬培養液中提取獲得的鏈霉素、卡那霉素和新霉素等；人工半合成的主要有阿米卡星、奈替米星等[10-11]。氨基糖苷類是濃度依賴型抗菌藥物,對需氧革蘭氏陰性菌和某些革蘭氏陽性菌有殺菌活性,但對厭氧菌幾乎沒有殺菌活性[10-11]。不同的氨基糖苷類藥物作用稍有區別。鏈霉素及其二氫衍生物作用于核糖體上的單一位點,但其他氨基糖苷類則作用于多個位點上[12-13]。氨基糖苷類具有殺菌作用,有劑量依賴性,而且有顯著的抗生素后效應。雖然從理論上講,β-內酰胺類通過藥物干擾細胞壁的合成,從而促進氨基糖苷類藥物滲透進入細菌細胞。然而,有一些動物用的制劑類型,例如：氨基糖苷類和普魯卡因青霉素鹽通過合并使用，確實可以增強殺菌的活性[14]。同時,細菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性是通過介導細菌酶實現的,這些細菌酶可以滅活氨基糖苷類并阻止其與核糖體結合。編碼這些酶的基因位于質粒上,這樣便于將耐藥性迅速轉移到其他細菌中[15-17]。

2 乳及乳制品中抗生素殘留的危害

抗生素的危害從它對細菌的作用機制來分析,主要有:阻礙細菌的細胞壁合成,致使細胞壁缺損死亡[18];抑制細菌細胞生存所必需的蛋白質合成[19]。首先,隨著各種抗生素在我國畜牧業中的不斷使用,一些與乳制品相關的細菌很容易產生耐藥性,甚至會產生交叉耐藥性,還會通過畜禽產品傳染給人體,使抗生素作用大大降低,甚至無效,并導致嚴重的公共衛生問題[20]。其次，長期食用含有抗生素的乳品,會破壞微生態平衡、抑制腸道菌群的正常生長,并產生耐藥性的致病菌,致使某些維生素(如維生素B族、維生素K)缺乏,機體免疫力下降[20]。最后,經常食用含有抗生素的乳品還會導致敏感人群產生過敏癥狀,甚至會導致過敏性休克,其主要癥狀為胸悶、呼吸困難、面色蒼白、脈細弱、血壓下降、大小便失禁、昏迷和意志喪失等,嚴重者可在短時間內死亡[20]。除此之外,抗生素殘留還有可能促使動物體產生基因突變、畸形和導致癌癥的發生等危害[21]。

3 乳及乳制品中抗生素的檢測

2001年,我國農業部發布實施了《無公害食品生鮮牛乳行業標準》[22],對新鮮牛乳的衛生指標明確了“不得抗生素檢出”的要求。但目前我國尚未能嚴格執行此行業標準,致使我國乳及乳制品中抗生素殘留問題一直未能得到解決,引起了人們對牛奶安全問題的擔憂[23]。

趙杰等[24]在2013年采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)對貴陽地區60份牛奶樣品進行檢測,結果顯示：抗生素殘留顯示陽性結果1份。安先霞等[25]使用TTC法對永靖縣部分奶牛養殖場隨機抽取40份生鮮乳樣品進行檢測,結果顯示：3份樣品呈抗生素殘留陽性,2份樣品為可疑樣品。Wang等[26]利用基于受體的化學發光酶聯免疫吸附試驗即TetR蛋白與四環素(TC)的特異性結合，檢測50個牛奶樣品中的四環素殘留(圖1(a)),結果顯示：3個樣品被確定為陽性；并且以TC計算的殘留水平發現:樣品A質量濃度為15 ng/mL;樣品B質量濃度為18 ng/mL;樣品C質量濃度為46 ng/mL。為了進一步確認,使用高效液相色譜法(HPLC法)進一步測定這些牛奶樣品[24],結果顯示:3種樣品都含有TC殘留物,其中樣品A中的TC質量濃度為18 ng/mL;樣品B中土霉素(OTC)質量濃度為25 ng/L;樣品C中的TC質量濃度為41 ng/mL)。其HPLC色譜圖見圖1(b),由此說明,我國乳制品殘留情況仍然存在。

圖1 (a)TetR蛋白的三維構象與(b)TC的分子對接復合物及3種陽性乳樣品的HPLC色譜圖[26]Fig.1 Three-dimensional conformation of TetR protein and molecular docking complex with TC (a) and HPLC chromatogram of three positive milk samples(b)[26]

4 乳及乳制品中抗生素殘留檢測方法

隨著食品安全問題越來越受到重視,食品安全檢測技術也在近些年來迅速發展,已經有許多便捷快速且靈敏度高的方法應用于乳及乳制品的抗生素殘留檢測中,主要有：微生物檢測法、理化檢測法、免疫分析法等。

4.1 微生物檢測法

微生物檢測法的測定原理是根據抗生素對微生物生理機能、代謝的抑制作用來定性確定樣品中抗微生物藥物的殘留,可以用作篩選技術,預先篩選可能存在的抗生素殘留物[27]。但是其結果誤差大,測定時間長,而且如果僅使用微生物檢測法來鑒定,也很可能出現不可測量的假陽性或假陰性結果。微生物檢測法主要有氯化三苯基四氮唑法(TTC)、戴爾沃試劑盒法和瓊脂擴散法等[28]。

4.1.1 氯化三苯基四氮唑法(TTC)

TTC法的原理是基于抗生素對微生物的抑制作用,最初是由Berridge[29]發明,將嗜熱鏈球菌培養基和酸堿顏色指示劑溴甲酚紫添加到牛奶樣品中,在孵育樣品期間,每30 min測定一次顏色,指示劑變色的時間可作為衡量抗菌藥物在牛奶中殘留濃度的一個指標。Galesloot等[30]利用嗜熱鏈球菌和亞甲基藍作為指示劑,進一步優化了酸堿指示劑,發現牛奶中青霉素G殘留檢測的靈敏度可以達到1 μg/L。

Hyun等[31]采用TTC法對奶牛場常用的5種磺胺類抗生素和2種喹諾酮類抗生素進行檢測,其結果為磺胺喹惡啉、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲氧嘧啶最低檢測質量濃度均為25 μg/L,磺胺二甲嘧啶和磺胺甲嘧啶最低檢測質量濃度均為50 μg/L,而兩種喹諾酮類抗生素由于含量極低，并沒有通過TTC法檢測出來。Eftychia等[32]用微生物抑制法，快速檢測牛乳中的10種抗生素,其中青霉素的最低檢測限為4 μg/L,符合國家檢測標準要求。陳芳[33]將TTC法與MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)兩種分析方法進行對比,用于牛奶中青霉素和鏈霉素殘留檢測。發現兩種方法結果一致,不加青霉素或鏈霉素的陰性試管內的乳液變成紅色,加不同濃度的青霉素或鏈霉素的陽性試管內的乳液未變色,結果見圖2。由圖2(a)可知：加青霉素的陽性試管和不加青霉素的陰性試管,從左到右的濃度分別為加青霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL;圖2(b)為加鏈霉素的陽性試管和不加鏈霉素的陰性試管,從左到右的濃度分別為加鏈霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL。

圖2 (a)TTC法檢測青霉素和(b)鏈霉素的試驗結果[33]Fig.2 Test results of penicillin test by TTC method (a) and test results of streptomycin test by TTC method (b)[33]

4.1.2 戴爾沃試劑盒法(Delvo-X-PRESS)

Delvo-X-PRESS(DSM Food Specialties)是一種基于酶的快速檢測方法,是為檢測奶罐和奶倉中β-內酰胺類殘留而專門設計的,只需幾分鐘就可以檢測出結果[34]。Delvo-X-PRESS是一種基于受體-酶的競爭性、定性檢測方法[34]。受體蛋白來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌,能夠特異性識別出多種β-內酰胺類,BCP(溴甲酚紫)用于指示反應信號,根據顏色反應(特異性生成黃色)可以判斷是否含有β-內酰胺類殘留,檢測結果通過肉眼或者自動化的讀數系統進行判斷,整個檢測耗時在10 min以內[34]。

崔晨光[34]采用戴爾沃試劑盒法對三元純牛奶和奶罐生鮮乳樣本中青霉素G和磺胺嘧啶兩種抗生素進行檢測后發現：三元純牛奶作為對照樣品檢測結果為陰性,奶罐生鮮乳檢測結果為陰性,說明隨機抽取的奶罐生鮮乳是合格的。青霉素G濃度在1 μg/L時,采用戴爾沃牛奶廣譜抗生素檢測試劑盒即可檢出,而其對磺胺類藥物也很敏感,在20 μg/L時即可檢出,結果見圖3。

圖3 (a)青霉素G檢測結果和(b)磺胺嘧啶檢測結果[34]Fig.3 Penicillin G test results(a) and sulfadiazine test results (b)[34]

4.1.3 瓊脂擴散法

瓊脂擴散方法(agar diffusion method)的原理是通過測定瓊脂平皿上標準受試微生物抑菌圈的大小,是一種目前應用最為廣泛的篩選技術[35-36]。孵育過程中,液體樣品會擴散到瓊脂培養基的基質中。孵育一段時間后(在8～36 h之間,確切時間取決于具體試驗),測量抑菌圈的大小。如果存在的抗菌濃度超過一定的限度,微生物生長會被抑制(微生物死亡/生長受抑制),在瓊脂平皿上可見清晰的抑菌圈,詳見圖4。該方法是檢測牛乳中抗生素殘留最傳統的方法[37-38]。

圖4 瓊脂擴散法[36]Fig.4 Agar diffusion method[36]

4.2 理化檢測法

4.2.1 反相液相色譜法

抗菌藥物分析最常用的是反相液相色譜(RPLC),RPLC固定相(3.5 或5.0 μm顆粒)由非極性或疏水性有機填料(如辛基、十八烷基、苯基或氰基基團)通過硅氧烷(甲硅烷基醚)鍵(—Si—O—Si—)附著在硅基載體的表面而形成[39]?；瘜W鍵合十八烷基硅烷(ODS、C18)或18個碳原子的烷烴是最常用的固定相;較短烷基鏈鍵合的色譜柱如C8、苯基或氰丙基鍵合相的非極性較小,偶爾可作為替代;反相填料的表面是疏水性的,其保留機制是疏水性、分配和吸附作用[40]。大多數抗菌藥物在反相色譜柱上的保留和分離情況良好,但氨基糖苷類化合物和林可霉素除外,需要使用離子對試劑或親水作用色譜(HILIC)來分析[41]。RPLC流動相由乙腈或甲醇、水和修飾劑組成。RPLC的保留程度和選擇性很大程度上取決于流動相的性質和組成、pH調節劑和流動相的離子強度[42]。

Han等[43]利用HPLC技術檢測了牛奶中36種抗生素的殘留情況,結果表明：以3和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.01～5 和0.03～10 μg/kg。所有分析物的LOQ遠低于中國和歐盟規定的標準,適用于牛奶中抗生素殘留的痕量分析。

4.2.2 高效液相-質譜聯用技術

液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)是液相色譜與質譜聯用的儀器。液相色譜流動相的組成以及緩沖液或添加劑的濃度和pH,對抗菌藥物的最佳電離效率、離子噴射穩定性和色譜分離至關重要。如何選擇合適的溶劑取決于需要分析的化合物的性質、采取的電離方法和所用的色譜柱[44-46]。LC-MS流動相最合適的溶劑是水、甲醇和乙腈。甲醇比乙腈柱后壓高。LC梯度洗脫過程中,柱后壓隨著流動相的黏性變化而呈比例變化。甲醇和水混合液比純甲醇或純水黏性大,40%甲醇水的黏性達到最大,為1.62 mPa/s[44]。然而,乙腈和水混合時,當乙腈比例增加時,黏度下降。在一些條件下,如反相液相-大氣壓化學離子源色譜(LC-APCI)或液相大氣壓光電離子源(LC-APPI),以及分析一些質子親和力相對較低的分析物時,最好用甲醇來提高離子化效率,因為甲醇的質子親和力(PA)低于乙腈。例如：采用LC/APCI-MS(液相色譜-大氣壓化學離子源-質譜聯用)分析質子親和力較低的甾體類化合物時,甲醇優于乙腈[45]。

Wang等[46]利用高效液相-質譜聯用技術檢測了牛奶中6種抗生素(紅霉素、青霉素G、鹽酸四環素、磺胺甲惡唑、鹽酸環丙沙星和青霉素V)的殘留情況,結果表明：6種目標化合物在10～200 μg/L范圍內呈良好的線性關系,R2為0.995～0.999。以3和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.4～3和0.1～0.5 μg/kg。

4.3 免疫分析法

免疫分析是指檢測抗體與抗原性分析物之間的特異性反應的方法[47]?，F代免疫分析方法起源于Hummel等[18]使用抗胰島素抗體測定人血漿中激素含量的研究工作[48]。免疫分析依據檢測的是初級抗原抗體反應或是二級反應,分為直接法和間接法兩種。免疫分析方法具有檢測限低、特異性高、操作簡單、分析時間短和易于自動化等優點。目前,已經報道了多種免疫分析方法,它們各具優缺點。已報道的用于獸藥殘留檢測的免疫分析方法很多,操作方法簡單的有側流層析法(Later-flow devices, LFDs)和試紙條法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射性免疫分析法(RIA)等,操作復雜且需要精密儀器的免疫分析方法有基于表面等離子體共振(SRP)的光學生物傳感器法[49]。

4.3.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

目前,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是最常見的一種免疫測定法。20世紀70年代，Engvall等[50]最早建立了ELISA技術[50]。首先將抗原或抗體包被在固相材料表面,加入樣品反應后,再通過適當方法分離結合和未結合組分,使得ELISA可用于檢測復雜樣品中的待測物,許多現代的生物分析方法大多是基于傳統的ELISA方法建立的(圖5)[51]。

圖5 酶聯免疫吸附實驗原理[51]Fig.5 Enzyme linked immunosorbent assay schematic[51]

傳統的ELISA通常使用顯色指示劑和底物,獲得可觀測的顏色變化,大多數文獻報道的ELISA方法或商品化的抗菌藥物殘留檢測試劑盒均基于顯色指示劑[52-53]。最新的ELISA技術已開始通過熒光、電化學發光和實時聚合酶鏈反應等來進行定量檢測。這些非酶類的指示信號具有多種優勢,如：靈敏度更高、多殘留檢測能力,微陣列檢測?，F在這些技術已被成功應用于食品中抗菌藥物的檢測[54-55]。雖然許多報道的ELISA方法既可使用多克隆抗體，也可使用單克隆抗體作為捕獲識別分子,但由于雜交瘤細胞可源源不斷地產生均一性的單克隆抗體,因此目前基于單抗的ELISA方法呈現增長的趨勢。2005年,Samsonova等[56]采用競爭ELISA法檢測牛奶中青霉素的殘留,檢測線性質量濃度范圍為2～32 ng/mL。

4.3.2 表面等離子體共振(SPR)生物傳感器技術

生物傳感器(Biosensor)是由生物辨識元件(BRE)和電化學轉換器構成的,是一種可將分析物的濃度轉化為電信號的裝置。最早的生物傳感器是一種催化體系,這個體系整合了生物受體(即酶、細胞器或微生物)和轉換器,可將生物反應轉化為電子信號[57]。當生物相互作用發生時,其他物化參數也隨之發生改變,包括焓、離子電導率和質量。根據這個效應,可以將生物催化作用和轉換器結合起來投入應用[58]。光學、電化學、感溫、壓電和電磁傳導都是常用的傳導機制。

SPR與大多數免疫化學分析技術相比,具有不需要酶標記或熒光標記目標物或識別元件的優點。SPR已經與微流控技術相結合,可實現結合復合物的連續、實時監控[59]。SPR可提供目標分子的濃度、結合特異性、親和力、動力學和協同效應等信息。

4.4 常見抗生素殘留檢測方法的優缺點

微生物檢測法、理化檢測法和免疫分析法是目前應用于乳及乳制品中抗生素殘留檢測的3種主要檢測方法,其各有優缺點(見表1)。微生物檢測法是根據抗生素對微生物生理機能、代謝的抑制作用來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留,檢測費用較低,但是測定時間長、特異性差、靈敏度低以及結果誤差大[27]。理化檢測法是一種根據抗生素的分子理化性質對其進行分離和檢測的方法,這種方法分析速度快、靈敏度高、結果穩定以及準確可靠,但是樣品前處理復雜、儀器昂貴和需專業操作人員操作[60-61]。免疫分析法是以抗原與抗體特異性結合為基礎的分析技術,其操作簡單、取樣量少和檢測快速,但由于其檢測面較窄、特異性抗原抗體價格較高等特點,導致免疫分析法的推廣和普及還需要很長的時間。

表1 常見抗生素殘留檢測方法的優缺點

5 結語

乳及乳制品中抗生素殘留問題是涉及人類健康的公共衛生問題,目前我國為了解決這個問題已經在不斷完善乳及乳制品中抗生素殘留的限定標準,科研工作者也一直在尋求簡便、快速、準確和靈敏度高的檢測方法,使得乳及乳制品中抗生素殘留檢測技術的研究得到了很好的發展。微生物檢測法由于其檢測時間長、靈敏度差以及易產生誤差而很少被應用于抗生素殘留的檢測。理化檢測是實驗室常用的操作方法,其高效靈敏、應用范圍廣,但常須要專門的人員進行操作,因此不適用于乳品企業的在線監測。免疫分析與生物傳感器的結合是近幾年研究的熱點,例如免疫膠體金層析技術,既可達到高特異性、高靈敏度的要求,而且還有效地實現可視化檢測,有效地避免了儀器分析中須要專業人員操作的問題,能很好滿足乳品企業的需求。但這種方法存在后滯現象,樣品使用前須進行稀釋處理,而且易出現假陰性或假陽性信號。目前很多商業化的試劑盒可以用于乳與乳制品中抗生素檢測,但由于價格昂貴,大批量測試花費巨大。隨著技術的發展,實現更加簡單快捷、靈敏高效、多組分抗生素同步分析的檢測是未來發展的趨勢。筆者建議應該繼續重視乳及乳制品中抗生素殘留的檢測技術的開發與改進,來滿足日趨嚴格的殘留限量檢測要求,實現檢測過程的智能化、自動化。