吸附樹脂分離蛹蟲草發酵液中蟲草素

周精衛,王松濤,沈才洪,趙谷林,顧煒煒,劉慶國,吳菁嵐,陳 勇，

(1.南京工業大學 國家生化工程技術研究中心,江蘇 南京 211800; 2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 616000；3.國家固態釀造工程技術研究中心,四川 瀘州 646000；4.江蘇省產業技術研究院,江蘇 南京 210032)

蟲草素,又稱蟲草菌素、蛹蟲草菌素,是蛹蟲草中(尤其是核苷類)主要活性成分,屬核苷類新藥——嘌呤類生物堿,也是第一個從真菌中分離出來的核苷酸抗生素[1-3],其具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用,有良好的臨床應用前景[4-7]。目前蟲草素的研究成為藥物化學中一個極其活躍的領域，但是蟲草素在野生冬蟲夏草中的含量極微,現在研究所用的蟲草素基本都是從蛹蟲草中提取的[8-9]。

人工培育蛹蟲草的方法主要有:野生蛹蟲草菌種的固態、液態深層發酵培養,獲得蛹蟲草的菌絲體和發酵產物;人工飼養蟲草蝙蝠蛾幼蟲,再接種蛹蟲草菌,在適宜培養條件下培養得到蛹蟲草子實體。采用液態培養方式生成的蟲草素大部分都分泌到發酵液中,便于后續的分離提取。但發酵液中蟲草素的濃度較低,從中分離提取的難度大,因此需要開發一種適用于蟲草素工業化生產的分離方法。目前在蟲草素生產上應用較多的方法是離子交換樹脂吸附法,此法存在樹脂的再生過程中酸、堿的用量多以及廢水的排放量大等缺點[10-11]。因此,有學者采用吸附樹脂從蛹蟲草發酵液中提取蟲草素[12-15],但依然存在樹脂對蟲草素的吸附容量低、吸附選擇性差等缺點,導致分離得到的洗脫液中蟲草素純度低,需要進一步純化[16]。

鑒于采用吸附樹脂具有易解吸、能重復使用、生產成本低等優點,本文中,筆者采用吸附樹脂來分離蛹蟲草發酵液中的蟲草素,首先篩選一種吸附/解吸性能較好的吸附樹脂,研究pH對吸附容量的影響,測定蟲草素在樹脂上的吸附等溫線,并采用動態柱吸附-脫附的方法分離發酵液中的蟲草素,系統地考察色譜柱的高徑比(H/D)、流速及溫度等條件對蟲草素在樹脂上的吸附的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

蛹蟲草發酵液,由南京高新工大生物技術研究院提供,采用蛹蟲草CICC14014進行發酵,最終發酵液中蟲草素的質量濃度為3～4 g/L。

發酵液的預處理:先通過離心去除發酵液中的菌體(4 000 r/min,15 min),得到的上清液繼續進行超濾(PT1812型有機卷式膜,美國GE公司),進一步去除發酵液中的蛋白質、色素等雜質。

吸附樹脂的預處理:吸附樹脂XAD-16、XAD-1600、KA-I、HD-01和HD-06由南京工業大學國家生化中心提供。樹脂在使用之前,先用6倍體積的無水乙醇浸泡,在浸泡過程中需要不斷攪拌,時間要超過4 h以便將樹脂中的雜質洗出,再用乙醇洗滌2～3遍后,用純水將樹脂中的乙醇沖洗干凈,備用。

1.2 檢測方法

采用安捷倫高效液相色譜法(安捷倫1260型,紫外檢測器),色譜柱為C18柱(安捷倫,SB-AQ),流動相為1.36 g/L的KH2PO4溶液和甲醇緩沖液(兩者體積比為75∶25),流速為1 mL/min,分析時間為25 min,紫外檢測器,檢測波長為260 nm。

1.3 靜態吸附/解吸

將預處理好的樹脂進行抽濾,取2 g抽濾好的濕樹脂,加入100 mL的錐形瓶中,然后精確加入50 mL蟲草素溶液,并用封口膜將錐形瓶密封好之后,放入搖床,在設定的溫度下,以120 r/min的速度振蕩8 h,使溶液和樹脂充分接觸,然后對上清液取樣,測定其中蟲草素的濃度。樹脂的靜態吸附容量的計算見式(1)。

(1)

式中:Qe為樹脂達到吸附平衡時的吸附容量,m為加入的樹脂質量,ρ0為初始溶液中溶質的濃度,ρe為達到吸附平衡時溶液中溶質的濃度,V0為初始溶液的體積。在吸附前后,溶液的體積基本上不發生變化。

靜態解吸:取2 g對蟲草素吸附飽和的濕樹脂(用濾紙抽濾后)放入100 mL的錐形瓶中,然后精確加入20 mL的解吸劑,再放入搖床中,在設定的溫度下,以120 r/min的速度振蕩8 h,使溶液和樹脂充分接觸,然后對上清液取樣,測定其中蟲草素的濃度。樹脂的靜態解吸率的計算見式(2)。

(2)

式中:R為樹脂的靜態解吸率,ρR為達到解吸平衡時溶液中溶質的濃度,VR為加入的解吸劑的體積。在解吸前后,溶液的體積基本上不發生變化。

1.4 動態吸附-脫附過程

采用帶夾套的玻璃層析柱,通過水浴對其進行控溫,柱子的尺寸:內徑為1.6 cm、高度為40 cm。采用濕法裝柱,將吸附樹脂裝入色譜柱中,并用純水將床層沖洗均勻。采用Kleinübing等[17]的方法測定床層的空隙率ε(約為0.33),將蟲草素提取液恒速流過層析柱,檢測流出液中蟲草素濃度,繪制動態吸附曲線。通過考察進樣流速、高徑比及溫度等因素對蟲草素在樹脂上的吸附效果,選擇合適的上樣條件。樹脂動態吸附容量的計算見式(3)。

(3)

式中:Qd為動態吸附容量(mg/g)；ρf和ρi(t)分別代表進口和出口溶液中溶質的質量濃度,g/L；Vf是進料的體積；Vb是床層的體積；Vi(t)是分部收集中每根試管中溶液的體積。

2 結果與討論

2.1 蟲草素在樹脂上的靜態吸附及脫附

2.1.1 樹脂的篩選

挑選了5種不同結構的樹脂,考察樹脂結構對發酵液中蟲草素吸附容量的影響,其中XAD-16、XAD-1600為大孔吸附樹脂,KA-I為中孔微孔樹脂,HD-01、HD-06是超高交聯度樹脂,樹脂的理化性質見表1。

表1 5種不同結構樹脂理化性質

在25和40 ℃條件下,考察樹脂對發酵液中蟲草素的靜態吸附容量的影響,結果如圖1所示。由圖1可知:在這兩個溫度條件下,蟲草素在各樹脂上的吸附容量趨勢一致,其中,HD-01和HD-06樹脂對蟲草素的吸附容量最高(20.2 mg/g),遠高于原晉波等[10]得到的1.3 mg/g的結果；其次是KA-I樹脂,而XAD-16和XAD-1600對蟲草素的吸附容量較低。這可能是由于超高交聯度的樹脂具有獨特的微孔結構,比表面積大,因此對蟲草素的吸附容量也大。由圖1還可知,除了HD-01樹脂之外,蟲草素在樹脂上的吸附容量隨溫度升高而降低,因此較高的溫度,有利于蟲草素的解吸。

圖1 蟲草素在5種樹脂上吸附-脫附性能對比Fig.1 Adsorption and desorption performance for cordycepin on five resins

除了吸附容量外,蟲草素在樹脂上的解吸難易程度也是需要重點考慮的。為了保證大部分的蟲草素被解吸下來,同時能對比出不同樹脂之間的脫附性能,采用50%的乙醇作為脫附劑,KA-I的解吸率達到了72.6%,其次是HD-06,達到了70.8%。雖然這兩種樹脂的解吸性能相近,但在吸附實際發酵液中蟲草素時,HD-06對色素的吸附能力較強,因此在后續的洗脫過程中,被吸附在樹脂上的色素也會進入蟲草素洗脫液,導致其顏色較深,影響最后產品的色澤。綜合考慮樹脂對蟲草素的吸附容量、解吸難易程度以及對色素的吸附選擇性,選擇KA-I樹脂作為分離發酵液中蟲草素的吸附劑。

2.1.2 乙醇濃度對解吸率的影響

由于蟲草素在樹脂上的吸附親和力較強,用水難以解吸,因此考慮采用不同濃度乙醇作為解吸劑。在室溫(25 ℃)條件下,考察濃度乙醇對蟲草素的解吸率的影響,結果見圖2。由圖2可知：隨著乙醇用量的增加,其對樹脂上吸附的蟲草素解吸能力增強,但當乙醇的體積分數超過70%后,解吸率反而下降。這可能是由于在室溫下蟲草素在乙醇中的溶解度較低,當水溶液中乙醇濃度超過一定值之后,對蟲草素的解吸能力反而下降。另外,采用體積分數50%的乙醇的解吸率為79.9%,僅比體積分數70%的乙醇(解吸率為81.5%)低一點。因此考慮到洗脫過程中乙醇的用量及回收利用,最終采用體積分數50%的乙醇為解吸劑。

圖2 乙醇用量對蟲草素在KA-I樹脂上脫附性能的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on desorption performance of cordycepin on KA-I resin

2.1.3 pH對蟲草素吸附容量的影響

在蟲草素分子中有一個含氮的堿基(腺嘌呤),所以蟲草素在不同pH條件下;解離狀態是不一樣的。因此,考察不同pH條件下,蟲草素在KA-I樹脂上的吸附容量,結果見圖3。由圖3可知:隨著溶液pH的升高,蟲草素在樹脂上的吸附容量逐漸增大;當溶液的pH>4.0后,其吸附容量達到一個穩定值(約為21.5 mg/g)。這與Zhang等[18]發現在pH為8.0時,蟲草素在NKA-II樹脂上的吸附容量達到最大的結果不一致。本研究的結果與文獻[18]報道的結果略有不同,可能是與選擇的吸附樹脂類型有關,因為在水溶液中蟲草素在KA-I樹脂上的吸附主要依賴范德華力作用,當其溶解度降低后,疏水性增強,更有利于其在樹脂上的吸附。因此,選擇在pH>4.0的條件下,對蟲草素吸附的效果較好。蟲草素發酵液的原始pH為5.0,因此,后續試驗不調節pH。

圖3 pH對蟲草素在KA-I樹脂上吸附吸附容量的影響Fig.3 Effects of pH on the adsorption capacity of cordycepin on KA-I resin

2.1.4 蟲草素在吸附樹脂上的吸附等溫線

在pH>4.0時,蟲草素在樹脂上的吸附容量較大,因此選擇pH=5.0時,考察在不同溫度(25、40和60 ℃)條件下,蟲草素在KA-I上的吸附過程,結果如圖4所示。由圖4可知：蟲草素在樹脂上的吸附容量隨著溫度的升高而逐漸下降。這說明蟲草素在KA-I上的吸附是一個放熱的過程,低溫有利于吸附,高溫有利于解吸。分別采用Langmuir和Freundlich模型對3個溫度下的等溫線數據進行擬合,擬合的結果列于表2中。由表2可知：這兩種模型都可以較好地擬合實驗數據,其中Freundlich模型擬合的程度更高,回歸系數R2達到95%以上。

圖4 蟲草素在樹脂KA-I上的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms of cordycepin on KA-I resin

表2 蟲草素在KA-I樹脂上的吸附模型擬合

2.2 蟲草素在色譜柱上的動態吸附-脫附研究

采用動態柱吸附的方法分離發酵液中的蟲草素,由于高徑比(H/D)、溫度及流速等條件對蟲草素的吸附影響較大,因此分別測定不同條件下,蟲草素在裝載KA-I樹脂的層析柱上的穿透曲線。

2.2.1 不同流速下蟲草素在KA-I樹脂上的穿透曲線

分別測定不同流速(0.5、1.0和1.5 mL/min)條件下,蟲草素在層析柱上的穿透曲線,結果如圖5所示。由圖5可知：在高徑比、溫度和進樣濃度一定的情況下,隨著流速的增加,蟲草素的穿透時間提前。溶液中蟲草素的穿透曲線較為緩和,從開始穿透(ρi(t)/ρ0>0.05)到完全達到吸附飽和(ρi(t)/ρ0接近1)所需的時間較長。這是由于進樣質量濃度較低(2.06 g/L),溶液中蟲草素濃度與樹脂之間的濃度差較小,傳質的推動力小，所以蟲草素在KA-I樹脂達到吸附平衡所需的時間較長。由圖5還可以看出,隨著流速的增大,蟲草素來不及在樹脂上達到吸附平衡,就開始流出,因此穿透時間提前。在較低的流速下,有利于蟲草素在KA-I樹脂上的吸附,可減少層析柱的傳質區長度，但在較低的流速下,分離所需的時間也相應較長。因此要綜合考慮傳質速率和生產效率,選擇1.0 mL/min的流速較為合適。

H/D=10∶1,進樣質量濃度2.06 g/L圖5 不同流速下蟲草素在KA-I樹脂柱上的穿透曲線Fig.5 Breakthrough curves of cordycepin on column with KA-I resin at various flow rate

2.2.2 不同高徑比下蟲草素在KA-I樹脂上的穿透曲線

如果增大層析柱的高徑比,則理論塔板數增大,在多組分體系中,各物質之間的分離度也相應增大；但隨著高徑比的增大,分離時間延長,柱壓也相應增加,相應的能耗增大，生產效率則下降。因此考察在不同高徑比(10∶1、15∶1和25∶1)條件下,蟲草素在KA-I柱中的穿透曲線,結果見圖6。由圖6可知:隨著高徑比的增大,蟲草素的穿透時間延后,達到吸附平衡的時間更長,所需的進樣體積也更大。在不同高徑比條件下,蟲草素在KA-I樹脂上的吸附容量接近(約為29.2 mg/g)，這可能是因為在蟲草素發酵液中除了蟲草素之外,還存在腺苷、蟲草酸等物質,特別是腺苷的結構與蟲草素非常相似,因此影響蟲草素的分離。為了實現這些組分之間的高效分離,因此可以考慮在較大的高徑比條件下進行操作。

進樣質量濃度1.96 g/L,流速1.0 mL/min圖6 不同高徑下蟲草素在KA-I樹脂柱上的穿透曲線Fig.6 Breakthrough curves of cordycepin on column with KA-I resin at different H/D

2.2.3 不同溫度下蟲草素在KA-I樹脂上的穿透曲線

考察在不同溫度條件下,蟲草素在KA-I樹脂柱中的穿透曲線,結果見圖7。由圖7可知：隨著溫度的升高,穿透曲線提前，這與所測定的蟲草素在KA-I樹脂上的吸附等溫線結果一致。由此可見,高溫更有利于蟲草素在KA-I樹脂上的脫附；隨著溫度的升高,蟲草素的穿透曲線更為陡峭,這跟預期的結果一致。這是因為蟲草素分子在水溶液中的布朗運動隨著溫度的升高而加劇,分子擴散系數增大,使其在樹脂上的傳質速率增大,能更快地達到吸附平衡。

H/D=10∶1,進樣質量濃度2.06 g/L,流速1.0 mL/min圖7 不同溫度下蟲草素在KA-I樹脂柱中的穿透曲線Fig.7 Breakthrough curves of cordycepin on column with KA-I resin at different temperatures

2.2.4 蟲草素在KA-I樹脂上的動態吸附-解吸曲線

圖8是在高徑比為25∶1、流速為1.5 mL/min、進樣質量濃度為1.65 g/L、進樣溶液pH為5.0的條件下,蟲草素在KA-I樹脂柱上的吸附-脫附曲線。由圖8可知：KA-I樹脂對蟲草素的動態吸附容量為29.2 mg/g,采用體積分數50%乙醇為洗脫劑,可以很快將被樹脂吸附的蟲草素洗脫下來,洗脫液中蟲草素的最高質量濃度達到了12.73 g/L。但由于后期,蟲草素洗脫曲線有一點拖尾,從而降低了洗脫液中蟲草素的平均濃度。最終,經計算洗脫液的平均質量濃度為1.22 g/L,收率達到了97%。

H/D=25∶1,流速1.5 mL/min,進樣質量濃度1.65 g/L圖8 蟲草素在KA-I樹脂柱中的動態吸附-脫附曲線Fig.8 Dynamic adsorption-desorption curves of cordycepin on column with KA-I resin from fermentation broth

2.3 蟲草素的結晶

從KA-I樹脂上洗脫得到的洗脫液中蟲草素的濃度較低,需要進一步濃縮。由于溶液的體積較小,直接采用真空旋轉濃縮的方法,待濃縮液中快出現沉淀時停止濃縮,此時濃縮液中蟲草素質量濃度約為60 g/L,然后放冰箱(4 ℃)靜置過夜,進行冷卻結晶。冷卻析出的固體進行抽濾、烘干,即得到蟲草素粗品。經過高效液相色譜(HPLC)檢測,粗品中蟲草素的含量約為85%,比文獻報道的35%[12]以及32.5%[18]都要高。

3 結論

采用吸附樹脂從發酵液中分離蟲草素,考察了樹脂的結構、溶液的pH、溫度、流速及高徑比等對蟲草素吸附性能的影響,并摸索得到合適的解吸條件,最后通過動態柱吸附、脫附的方式,分離得到了蟲草素粗品。①KA-I樹脂對蟲草素具有較高的吸附容量,達到了21.5 mg/g,采用體積分數50%的乙醇作為解吸劑,靜態解吸率可達到79.9%。②蟲草素的吸附容量隨溫度的升高而降低,吸附平衡數據符合Freundlich模型,回歸系數R2達到95%以上。③蟲草素的動態柱吸附容量可達29.2 mg/g,洗脫液中蟲草素的質量濃度可達1.22 g/L,收率達到97%,粗品中蟲草素的含量約為85%。由此可見,該方法操作簡單,得到的蟲草素含量高,具有一定的工業化應用前景。