羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑HPLC指紋圖譜的相關(guān)性

黃楊敏,沈治平,朱阿金,李 超

(濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司,江蘇 泰興 225441)

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉,具有平肝安神,清熱利水的功能,可用于肝陽眩暈,心悸失眠,浮腫尿少等癥[1]。現(xiàn)代研究表明[2-6]:羅布麻葉具有降血壓、降血脂、保肝及抗抑郁等明顯功效。其主要化學(xué)成分為黃酮類、鞣質(zhì)類和有機(jī)酸類等[7]。本研究使用的羅布麻葉飲片來源于新疆地區(qū),而新疆是羅布麻葉的主產(chǎn)區(qū)[8]。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)過水提、濃縮、干燥及制粒而成,經(jīng)過中醫(yī)臨床配方后,供患者即沖即服的顆粒,這在很大程度上解決了傳統(tǒng)中藥煎煮復(fù)雜、不便攜帶且質(zhì)量無保證的問題[9],但是我國對(duì)于中藥配方顆粒的生產(chǎn)仍處于試驗(yàn)研究階段,無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),因而無法確定產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)劣。根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]要求,中藥配方顆粒的原料、中間體和成品三者藥效物質(zhì)的指紋或特征圖譜應(yīng)保持一致性,并具有相關(guān)性。

但目前關(guān)于羅布麻葉的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究較多的是其藥材或提取物的指紋圖譜,而關(guān)于羅布麻葉配方顆粒的指紋圖譜較少,且目前還沒有對(duì)于羅布麻傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒HPLC指紋圖譜相關(guān)性的研究報(bào)道。因此本研究利用HPLC法建立了羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒的指紋圖譜,并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行了評(píng)價(jià),以期為羅布麻葉配方顆粒生產(chǎn)過程質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AD型高效液相譜儀,色譜系統(tǒng)由DGU-20A5R型脫氣機(jī)、SPD-20A型紫外可見檢測(cè)器、S/L-20AHT UFLC型進(jìn)樣裝置組成,日本島津制作社;XSE205DU型電子分析天平,上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司;SY8200T型超聲儀,上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司。

1.2 材料

1.2.1 對(duì)照品

金絲桃苷(批號(hào):110753-201415,純度94.9%),槲皮苷(批號(hào):100081-201610,純度90.6%),中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 樣品

羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,批號(hào):190414、190415和190416;羅布麻葉配方顆粒,批號(hào):1907013、1908013和1908023,濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司自制。

1.2.3 試劑

乙腈為色譜純,H2O為超純水,其余試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm色譜柱;2 g/L 的H3PO4-乙腈溶液作為流動(dòng)相,梯度洗脫程序見表1,其檢測(cè)波長為360 nm,柱溫為40 ℃,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.2 供試品溶液的制備

精密量取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑5 mL或精密稱取配方顆粒0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液50 mL,稱質(zhì)量,超聲處理60 min(功率200 W,頻率58 kHz),放冷,稱質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液補(bǔ)足減損質(zhì)量,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備

1)金絲桃苷對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對(duì)照品適量,用甲醇制備成1 mL含金絲桃苷36 μg的對(duì)照品溶液,即得。

2)槲皮苷對(duì)照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對(duì)照品適量,用甲醇制備成1 mL含槲皮苷1 mg的對(duì)照品溶液,即得。

1.3.4 方法學(xué)考察

1)耐用性試驗(yàn)

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,分別進(jìn)行色譜柱、柱溫以及流速耐用性試驗(yàn)。色譜柱包括:Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm;Agilent ZORBAX SB-Phenyl,250 mm×4.6 mm,5 μm;Phenomenex Luna C18100A,250 mm×4.6 mm,5 μm;Waters Xselect HSS T3,250×4.6 mm,5 μm;柱溫包括35、40及45 ℃;流速包括0.8、1.0及1.2 mL/min;其余色譜條件同1.3.1節(jié),測(cè)定HPLC色譜圖,計(jì)算相似度。

2)進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定HPLC色譜圖,計(jì)算相似度。

3)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法平行制備6份供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進(jìn)樣,測(cè)定HPLC色譜圖,計(jì)算相似度。

4)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別于0、2、4、6、8、12、18、24和48 h進(jìn)樣,測(cè)定HPLC色譜圖,計(jì)算相似度。

5)共有峰的辨識(shí)

取羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按2.3節(jié)中的方法制備對(duì)照品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進(jìn)樣,測(cè)定HPLC色譜圖。

6)樣品的測(cè)定

分別取3批羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑、羅布麻葉配方顆粒,按1.3.2節(jié)中的方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)中的條件分別進(jìn)樣,測(cè)定HPLC色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)[11]計(jì)算各條件下指紋圖譜的相似度。色譜柱耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知：表中各數(shù)據(jù)表示此行此列所對(duì)應(yīng)的兩種色譜柱之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，Kromasil與Kromasil品牌結(jié)果之間的相似度為1.000，Kromasil與Agilent品牌結(jié)果之間的相似度為0.951，Kromasil與Phenomenex品牌之間的相似度為1.000，Kromasil與Waters品牌結(jié)果之間的相似度為1.000。綜上，4種色譜柱HPLC指紋圖譜相似度對(duì)比結(jié)果均大于0.950，表明各色譜柱耐用性良好。

表2 色譜柱耐用性相似度

柱溫耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知：表中各數(shù)據(jù)表示此行此列所對(duì)應(yīng)的兩種色譜柱溫度之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，35與35 ℃條件下結(jié)果之間的相似度為1.000，35與40 ℃條件下結(jié)果之間的相似度為0.998，35與45 ℃條件下結(jié)果之間的相似度為1.000。綜上，表3中不同柱溫條件下HPLC指紋圖譜相似度對(duì)比結(jié)果均大于0.990，表明各柱溫耐用性良好。

表3 柱溫耐用性相似度

流速耐用性結(jié)果見表4。由表4可知：表中各數(shù)據(jù)表示此行此列所對(duì)應(yīng)的兩種色譜柱溫度之間的相似度。以第一行為例(從左至右)，0.8 mL/min與0.8 mL/min條件下的流速結(jié)果之間的相似度對(duì)比結(jié)果為1.000，0.8 mL/min與1.0 mL/min條件下流速結(jié)果之間的相似度為1.000，0.8 mL/min與1.2 mL/min條件下流速結(jié)果之間的相似度對(duì)比結(jié)果為1.000。以上可知，流速HPLC指紋圖譜相似度為1.000。綜上， 表4中各流速面相比結(jié)果均良好。

表4 流速耐用性相似度

方法學(xué)試驗(yàn)中,各耐用性試驗(yàn)結(jié)果良好,其中色譜柱耐用性相似度偏低,但最低相似度仍能達(dá)到0.950,最后選擇了Kromasil 100-5-C18色譜柱,是因?yàn)榇松V柱分離度較好且無顯著拖尾現(xiàn)象;進(jìn)樣精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)的共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD值均小于3%,說明該種方法進(jìn)樣精密度、重現(xiàn)性和48 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。以上結(jié)果表明：該方法可被應(yīng)用于羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜。

在對(duì)羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋譜圖摸索試驗(yàn)中,首先對(duì)流動(dòng)相的體系進(jìn)行了考察,先考察了乙腈-水、甲醇-水兩個(gè)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)分離效果不如乙腈-水系統(tǒng),考慮到羅布麻葉中含有黃酮類和酚類物質(zhì),在流動(dòng)相中加入離子抑制劑來抑制酚羥基離子化[12],如醋酸、H3PO4和甲酸,結(jié)果表明：H3PO4-乙腈的分離效果最為理想。樣品檢測(cè)時(shí)采用PDA檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長掃描,全面考察不同吸收波長的色譜圖,重點(diǎn)考察了256和360 nm處的譜圖特征,結(jié)果顯示：360 nm處色譜信息豐富,基線更加平穩(wěn),故選擇360 nm作為吸收波長。提取條件方面,考慮到便捷性采用超聲提取法。因羅布麻葉配方顆粒提取溶劑為H2O,故分別使用H2O、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇和相同濃度的甲醇進(jìn)行提取,結(jié)果顯示：相同濃度甲醇與乙醇作為提取溶劑無顯著差異,考慮到甲醇具有毒性故選擇乙醇,且采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取的色譜圖分離效果好,故選擇體積分?jǐn)?shù)50%乙醇作為提取溶劑。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果中,試驗(yàn)共標(biāo)定7個(gè)共有峰,以1號(hào)峰為參照峰,計(jì)算其余6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值,結(jié)果見表5和6。如表5所示：各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.00%；如表6所示：各峰相對(duì)峰面積RSD值均小于1.00%,以上均說明該方法進(jìn)樣精密度良好。

表5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果中,試驗(yàn)共標(biāo)定7個(gè)共有峰,以1號(hào)峰為參照峰,計(jì)算其余6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值,結(jié)果見表7和8。如表7所示：各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于1.00%。如表8所示：各峰相對(duì)峰面積RSD值均小于等于3.00%；以上均表明該方法重現(xiàn)性良好。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表8 重復(fù)性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果中,試驗(yàn)共標(biāo)定7個(gè)共有峰,以1號(hào)峰為參照峰,計(jì)算其余6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值,結(jié)果見表9和10。如表9所示：各峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.00%。如表10所示：各峰相對(duì)峰面積RSD均小于1.00%,以上均表明該方法48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表10 穩(wěn)定性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積

2.3 色譜峰的辨認(rèn)結(jié)果

相同色譜條件下,金絲桃苷、槲皮苷與羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜各色譜峰比較,發(fā)現(xiàn)羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中的1號(hào)峰、4號(hào)峰與金絲桃苷、槲皮苷保留時(shí)間吻合,故將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中的1號(hào)峰、4號(hào)峰分別鑒定為金絲桃苷、槲皮苷，對(duì)比情況見圖1，這與《中國藥典》2015年版第一部中羅布麻葉的含量測(cè)定項(xiàng)為金絲桃苷相一致[13-14]。

圖1 羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑對(duì)照指紋圖譜Fig.1 Reference HPLC fingerprints of traditional decoction of Apocynum venetum leaves

現(xiàn)代研究表明,黃酮類化合物是羅布麻葉中最重要的活性成分,例如金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素和槲皮苷等。前期研究還發(fā)現(xiàn)[13-14]：羅布麻葉配方顆粒指紋圖譜中可以指認(rèn)出槲皮素,但在羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜中未出現(xiàn),原因可能是羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑濃度較低,物質(zhì)含量少,未達(dá)到檢測(cè)限;羅布麻葉飲片指紋圖譜中指認(rèn)出綠原酸,但在羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒液相色譜圖中綠原酸對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處有兩個(gè)峰疊加在一起,極有可能是羅布麻葉經(jīng)過煎煮后與綠原酸結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)有所增加,具體情況仍有待進(jìn)一步探討。

2.4 樣品的測(cè)定結(jié)果

將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和羅布麻葉配方顆粒HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)[11],比對(duì)后發(fā)現(xiàn),羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的7個(gè)共有特征峰,在羅布麻葉配方顆粒中均有顯示,且通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)[11],計(jì)算了各樣品共有色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)模式中對(duì)應(yīng)的色譜峰的相似度,發(fā)現(xiàn)對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.950。圖2為羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜對(duì)比圖。由圖2可知：羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的7個(gè)共有特征峰在羅布麻葉配方顆粒中均有顯示，說明羅布麻葉配方顆粒在生產(chǎn)過程中的主要物質(zhì)種類與傳統(tǒng)湯劑相一致。表11為HPLC指紋圖譜相似度，由表11可知：通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)[11]，計(jì)算了各樣品共有色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)模式中對(duì)應(yīng)的色譜峰相似度，發(fā)現(xiàn)各配方顆粒、傳統(tǒng)湯劑與對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.950。表格中的數(shù)據(jù)表示此行此列所對(duì)應(yīng)的兩種物質(zhì)之間的相似度，以第一行為例，前3個(gè)1.000分別為配方顆粒1與配方顆粒1、配方顆粒2、配方顆粒3結(jié)果之間的相似度，0.901為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑1結(jié)果之間的相似度，0.926為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑2結(jié)果之間的相似度，0.918為配方顆粒1與傳統(tǒng)湯劑3結(jié)果之間的相似度，0.981為配方顆粒1與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度。

S1為1907013批羅布麻葉配方顆粒;S2為1908013批羅布麻葉配方顆粒;S3為1908023批羅布麻葉配方顆粒;S4為190414批傳統(tǒng)湯劑;S5為190415批傳統(tǒng)湯劑;S6為190416批傳統(tǒng)湯劑圖2 羅布麻葉配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑指紋圖譜對(duì)比圖Fig.2 Comparison on HPLC fingerprints of formula granules and traditional decotion of Apocynum venetum leaves

表11 HPLC指紋圖譜相似度

3 結(jié)論

通過對(duì)羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑以及配方顆粒的HPLC指紋圖譜相關(guān)性進(jìn)行研究,闡明了羅布麻葉配方顆粒在生產(chǎn)過程中與傳統(tǒng)湯劑的成分基本保持一致。本試驗(yàn)將羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑和羅布麻葉配方顆粒的指紋圖譜通過系統(tǒng)處理后,發(fā)現(xiàn)對(duì)照指紋圖譜相似度大于0.950,說明羅布麻葉配方顆粒與羅布麻葉傳統(tǒng)湯劑的相似度很高,且兩者均有相同的7個(gè)共有峰,因此能夠確定兩者成分基本保持一致,且具有良好的相關(guān)性,該HPLC指紋圖譜可應(yīng)用于羅布麻葉配方顆粒生產(chǎn)過程,以監(jiān)控其質(zhì)量變化,為羅布麻葉配方顆粒工業(yè)化生產(chǎn)提供了有關(guān)科學(xué)依據(jù)。