馬鈴薯甲蟲LdATPaseE調控幼蟲蛻皮的分子機制

廖蘭蘭，王 俊，付開赟，丁新華，何 江，吐爾遜·阿合買提，郭文超

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3. 新疆農業農村廳植物保護站，烏魯木齊 830049；4.新疆農業科學院博士后工作站/新疆農業大學博士后流動站，烏魯木齊 830091；5. 新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】液泡型H+-ATP酶(vATPase)定位于幾乎所有昆蟲上皮組織的頂膜中，激活膜以吸收和/或分泌離子和流體，并在許多生理功能中起重要作用。這類酶可以通過水解ATP成ADP和磷酸，將氫離子泵出膜外，維持細胞膜電位，幫助膜上其它載體吸收或分泌離子或液體。囊泡型H+-ATP酶(vesicular H+-ATPase，vATPase)驅動H+的跨過細胞膜的運輸，形成跨膜H+電位差；H+電位差則驅動Na+和/或 K+/H+反向轉運載體，而Na+/K+通過主動運輸從血淋巴中運往中腸腸腔，腸腔內Na+/K+則激發Na+/K+依賴的氨基酸吸收[1]。vATPase驅動的H+的跨膜運輸是昆蟲吸收氨基酸的動力基礎，因此，在昆蟲營養吸收過程中具有非常重要的作用，沉默vATPase的亞基常導致昆蟲死亡[2-7]。【前人研究進展】前人的研究已克隆出馬鈴薯甲蟲中vATPase 3個亞基A、B和E的基因片段，并發現這3個亞基的dsRNA均引起馬鈴薯甲蟲二齡幼蟲的死亡[5,8]。【本研究切入點】通過喂食馬鈴薯甲蟲不同劑量的dsLdATPaseE，可導致幼蟲在取食量、行動力、入土能力、化蛹率、羽化率隨dsLdATPaseE劑量依賴性的下降現象。采用RACE技術克隆了馬鈴薯甲蟲vATPaseE的編碼基因LdATPaseE全長，應用RNAi技術測定了敲低LdATPaseE對馬鈴薯甲蟲幼蟲蛻皮的影響，闡明馬鈴薯甲蟲ATPaseE基因調控幼蟲蛻皮分子機制。【擬解決的關鍵問題】干擾LdATPaseE了解影響幼蟲體重及化蛹的分子機理，LdATPaseE通過IIS信號途徑，調節保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)信號途徑，以及影響幼蟲生長和發育。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬鈴薯甲蟲

馬鈴薯甲蟲于2018年5月源于新疆農業科學院安寧渠綜合試驗場天敵資源繁育研究中心，其飼養條件為溫度(26±1)℃、相對濕度50%～60%和光周期16L∶8D。收集的幼蟲在養蟲室用新鮮馬鈴薯嫩葉飼養，分別飼養至二齡、三齡和四齡開始用于試驗。

1.1.2 主要藥劑

總RNA提取試劑(TRIzol)購自Invitrogen公司，引物合成購自南京金斯瑞公司、SuperScript III反轉錄酶、Oligo (dT)18隨機引物、TaqDNA聚合酶、dNTP mixture (2.5和10 mmol/L) 、RNase抑制劑、DNA Marker購自TaKaRa寶生物公司。pGEM-T easy vector購自Promega公司。DNA凝膠回收試劑盒為AXYGEN公司或Promega公司產品；感受態細胞購自北京全式金公司；其他試劑為國產AR級或進口產品如酵母提取液(yeast extract)和胰蛋白胨(tryptone) 為Oxiod公司產品。保幼激素類似物吡丙醚(Pyr)和蛻皮酮類似物氯蟲酰肼(Hal)為南京農業大學友情提供。

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯甲蟲ATPase基因表達載體的構建1.2.1.1 馬鈴薯甲蟲vATPase基因的克隆

馬鈴薯甲蟲vATPase的E亞基首先是由報道的E亞基序列為基礎[5]，搜索馬鈴薯甲蟲轉錄組數據，并獲得ATPaseE的完整序列，搜索程序為本地化BLAST程序包(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，同源序列搜索過程中選定E值為10-5，獲得的目的基因的片段序列經過CAP3組裝，組裝結果在nr數據庫中進行同源搜索分析驗證。利用Premier 5.0設計End to End引物驗證序列的完整性，5’RACE引物為5’-CGTTTGTGACCTGACCAAGTCGTTTA-3’，3’RACE引物為5’-TCCCAAATCCTGGAAAGCCTCA-3’。

PCR反應體系(25 μL): cDNA 模板1 μL, dNTP 1 μL, 10×Mg2+Buffer 2.5 μL, 上下游引物各1 μL，其余用ddH2O補齊。PCR反應條件: 94℃ 60 s; 94℃ 30 s, 52℃ 30 s,72℃ 2 min, 循環40次; 72℃ 10 min。反應完成后樣品通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶切膠回收，回收樣液直接送公司測序。

1.2.1.2 dsRNA原核表達系統的構建

實驗用大腸桿菌EscherichiacoliHT115(DE3) RNaseШ 缺失品系和南京農業大學惠贈的pET-2p dsRNA表達載體。載體構建方法參照[9]，用于構建ATPaseE-1/2 [(ATPasesubunitE-1/2), 參與H+跨膜運輸]，FTZ-F1 [蛻皮激素基因(Fushi tarazu-factor 1), 參與蛻皮激素信號轉導],AS-C[咽側體靜止激素c基因(allatostatin-c gene)，參與調節保幼激素合成],JHAMT[保幼激素甲基轉移酶基因(juvenile hormone acid methyl transferase gene)，參與保幼激素的合成],SHD(細胞色素314a1和Cyp314a1基因，參與20-羥蛻皮酮的合成)的dsRNA的cDNA片段根據已有報道[10-11]，egfp為對照，PCR克隆獲得，獲得的各個組織的混合模板cDNA 1.0 μL，參照TaKaRa公司rTaq反應體系以25 μL反應體系進行克隆，PCR 反應條件: 94℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，循環35次；72℃ 10 min。反應獲得的片段連入全式金公司pEasy-T3載體，最終挑取獲得的陽性克隆送南京金斯瑞測序，測序獲得的結果通過GeneDoc比對序列的正確性。驗證的片段通過菌液擴大培養并提取含有片段的Transit-T1載體，通過EcoRI酶切產生粘性末端，目標片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離后通過膠回收純化，利用T4連接酶連入已通過EcoRI產生粘性末端的pET-2p載體，連接完成的載體轉入HT115(DE3)細胞中在含有卡那霉素(50 μg/mL)和四環素(12.5 μg/mL)的固體培養基篩選陽性克隆。獲得的陽性克隆通過測序和異丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導發酵dsRNA驗證結果。誘導發酵的步驟參照呂東摸索的條件[12]，在菌液重新擴大培養至OD600=1.0時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，發酵表達dsRNA 6 h即可獲得穩定表達的濃度約為0.05 μg/μL的dsRNA[8]。以上所用試劑盒均按照其說明書的標準化程序進行。表1

表1 用于構建dsRNA表達載體的引物Table 1 Primers used in dsRNA synthesis

1.2.2 生物測定

根據方法[13-14]，試蟲對菌液有顯著的拒食作用，以及取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片1 d即能達到最佳效果[9]，以及0.05和0.1 μg/mL的保幼激素吡丙醚類似物(Pyr)和氯蟲酰肼(Hal)點滴處理幼蟲并不會引起可見的負作用[15]。在以上條件下，設計以下10個獨立的生物測定實驗。

3組實驗用于測定20E信號通道對四齡幼蟲體內LdATPase的抑制作用。第一組實驗測試20E和Hal對LdATPase表達的影響：處理組為(1)ddH2O浸潤葉片(對照)，(2)20E浸潤葉片，(3)Hal浸潤葉片，喂食1 d。實驗二為敲低LdSHD：處理組為(1)PBS浸潤葉片(空白對照)，(2)dsegfp浸潤葉片(負對照)，(3)dsLdSHD浸泡葉片，喂食3 d。實驗三為敲低LdFTZ-F1：處理組為(1)PBS浸潤葉片(空白對照)，(2)dsegfp浸潤葉片(負對照)，(3)dsLdFTZ-F1浸泡葉片，喂食3 d。以上每個實驗處理組均重復3次，用于提取RNA。

3組實驗用于測定JH信號通道對LdATPase表達量的影響。實驗一測試JH和Pyr對LdATPase表達的影響：處理組為(1) ddH2O浸潤葉片(對照)，(2) JH浸潤葉片，(3) 0.1 μg/mL Pyr浸潤葉片，喂食1 d。實驗二為敲低LdAS-C：處理組為(1)PBS浸潤葉片(空白對照)，(2)dsegfp浸潤葉片(負對照)，(3)dsLdAS-C浸泡葉片，喂食3 d。實驗三為敲低LdJHAMT：處理組為(1)PBS浸潤葉片(空白對照)，(2)dsegfp浸潤葉片(負對照)，(3)dsLdJHAMT浸泡葉片，連續喂食3 d。以上每個實驗處理組均重復3次，然后用于提取RNA。

3組實驗用于測定不同濃度dsLdATPaseE-1對三齡和四齡幼蟲的影響。7個處理包括PBS、dsegfp、和dsLdATPaseE-1菌液稀釋100、101、102、103和104倍。每個處理重復6次。飼喂3 d后，取3個重復用于提取RNA；另3個重復用于測量體重及觀察化蛹情況。

2個實驗測定敲低三齡和四齡幼蟲體內的LdATPaseE對IIS、JH和20E信號轉導途徑的影響。飼喂方法為1 d’dsRNA+2 d’PBS。共有4組處理：(1) PBS浸潤葉片(空白對照)，(2)dsegfp浸潤葉片(負對照)，(3) dsLdATPaseE-1浸泡葉片，(4) dsLdATPaseE-2浸泡葉片。每個處理重復9次。飼喂3 d后，3個重復用于提取RNA；3個重復用于提取JH；另3個重復用于提取20E。

1.2.3 20E與JH

20E由之前報道的超聲波方法提取[14]其滴度(ng / g體重)通過LC串聯質譜儀-質譜儀系統分析(LC-MS/MS)，方法步驟按照之前報道的方法進行試驗[15]。

血淋巴與JH的提取參照之前報道的方法[16]。LC-MS用來定量JH的滴度(ng / mL)[17]。

1.2.4 實時熒光定量PCR

qPCR引物利用GenScript在線網站設計，參數選擇默認，實時熒光定量PCR 反應采用熒光染料SYBR Green I，在ABI 7500 或ABI 7300 Real-Time PCR System上進行。使用SYBR Premix ExTaq(TIi RNaseH Plus)進行PCR反應，加入的參比染料為Rox Reference Dye II或Dye。

cDNA模板來自于一齡、二齡、三齡和四齡幼蟲，每個齡期間隔1 d取樣，四齡間隔8 h取樣，進入漫游期的幼蟲間隔1 d取樣。dsRNA處理樣品選自3次生物學重復中存活個體。對于組織表達分析cDNA模板取自4齡3 d幼蟲的胸肌、腦-咽側體復合體、腹神經索、前腸(FG)、中腸(MG)、馬氏管(MT)、回腸(IL)、直腸(RE)、血細胞(HC)、表皮(EP)、腹神經節(VG)和脂肪體(FB)。對于所有的樣品，RNA通過試劑盒SV Total RNA Isolation System Kit (Promega)提取。每一組樣品包含5～30的個體并且均有3次生物學重復。定量的mRNA檢測通過qRT-PCR檢測，均有3次技術重復。基因的相對表達量根據2-△△CT方法計算[18-19], 通過內參基因 (RP18和ARF4)校準[20]。qPCR反應體系為20 μL: RNA使用1 μg, qPCR Mix Buffer 10 μL, qPCR上下游引物各0.8 μL, ROX Reference Dye I 0.4 μL, 剩余ddH2O補齊。qPCR的反應步驟參考ABI 7300默認反應程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 31 s, 共40個循環。表2

表2 用于qRT-PCR的引物Table 2 Primers used in qRT-PCR

1.3 數據處理

qRT-PCR數據采用2-ΔΔCT方法計算相對表達量，其中：ΔΔCT=ΔCT樣品-ΔCT參照物，ΔCT=CT靶基因-CT內參基因，并以平均數±標準誤表示(3次重復)，各發育階段mRNA相對表達量比較采用ANOVA的Tukey-Kramer分析進行統計檢驗。統計分析使用的軟件為SPSS(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯甲蟲發育過程中LdATPaseE的時空表達

研究表明，LdATPaseE在所有測定的組織中均表達。LdATPaseE在回腸、直腸中表達量最高，在馬氏管、中腸和前腸中的表達量相對中等，在脂肪體、腹神經索、表皮和血細胞中的表達量最低。

LdATPaseE在各個齡期皆有表達。在一齡、二齡和三齡的幼蟲中，LdE75在蛻皮后出現高峰，在齡末期出現低谷。在四齡幼蟲中，LdATPaseE的最高峰出現在蛻皮后72 h，低谷出現在蛻皮后96 h。圖1

注：測定組織表達時，cDNA模板來自于3日齡四齡幼蟲的前腸(FG)、中腸(MG)、馬氏管(MT)、回腸(IL)、直腸(RE)、血細胞(HC)、表皮(EP)、腹神經節(VG)和脂肪體(FB)。測定不同發育階段的表達時，cDNA模板來自于間隔1 d的一齡(I1D0、I1D1、I1D2)、二齡(I2D0、2D1、I2D2)、三齡(I3D0、I3D1、I3D2)幼蟲和間隔8 h的四齡(I4H0、I4H8、I4H16、I4H24、I4H32、I4H40、I4H48、I4H56、I4H64、I4H72、I4H80、I4H88和I4H96)幼蟲，IxD0/IxH0表示剛蛻皮的幼蟲。測定基因的相對表達量時, 共有3個生物學重復，每個重復包括5～30個體。相對表達量經qRT-PCR測定，每個生物學重復設置3個技術重復。柱狀圖表示平均數±標準誤。柱頂不同字母表示P < 0.05水平差異顯著

2.2 激素調節LdATPaseE的表達機制

2.2.1 20E抑制LdATPaseE的表達

研究表明，在馬鈴薯甲蟲L.decemlineata中 20E滴度的高峰和LdATPaseE的表達水平的低谷同時出現，這表示20E可能抑制LdATPaseE的表達。測試處理為：喂食水浸泡(CK)、Hal和 20E浸泡的葉片，時間為1 d。相比于對照CK的樣品，LdATPaseE的表達量在Hal和20E處理樣品中顯著下降。

RNAi降低LdSHD的表達水平后，LdATPaseE的表達mRNA水平顯著上升。RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲體內LdFTZ-F1后，LdATPaseE的mRNA水平顯著上升。圖2

注：A：剛蛻皮的四齡幼蟲取食水處理的馬鈴薯葉片(control)、0.1 μg/mL處理或10-6 M的 20E處理的葉片1 d；B：取食PBS、dsegfp、或dsSHD浸泡的葉片3 d；C：或取食PBS、dsegfp或 dsFTZ-F1浸泡葉片3 d。柱狀圖表示平均數±標準誤。柱頂不同的大寫或小寫字母表示在P< 0.05或P<0.01水平差異顯著

2.2.2 JH不參與調控LdATPaseE的表達

研究表明，馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲攝取JH及其類似物吡丙醚后，對LdATPaseE表達量不明顯影響。采取RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲體內LdAS-C后，JH滴度應上升，但LdATPaseE的mRNA水平仍無變化。采取RNAi方法敲低馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲體內LdJHAMT后，JH滴度應下降，但LdATPaseE的mRNA水平仍無變化。在馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲階段，JH不參與調控LdATPaseE的表達。圖3

注：A：剛蛻皮的四齡幼蟲取食水處理的馬鈴薯葉片(control)、0.1 μg/mL的吡丙醚或10-6 M的JH1 d。B：或者剛蛻皮的四齡幼蟲取食PBS、dsegfp或dsAS-C浸泡的葉片3 d; C：或PBS、dsegfp或dsJHAMT浸泡的葉片3 d。不同的大寫和小寫字母表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著

2.2.3 激素調節LdATPaseE的表達機制

馬鈴薯甲蟲三齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2或5 d PBS處理葉片后，LdInR的mRNA水平分別上調了2.0和3.3倍，以及2.5和4.0倍。Ld4EBP的表達水平則分別上調了2.3 和3.0倍，以及3.5和4.1倍。馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdInR的mRNA水平分別上調了4.4和6.0倍。Ld4EBP的表達水平則分別上調了3.5 和2.9倍。可見，取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片抑制了馬鈴薯甲蟲幼蟲體內的IIS信號轉導途徑。

馬鈴薯甲蟲三齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 或5 d PBS處理葉片后，LdAS-C表達水平顯著上升了3.6和3.0倍，以及2.5和2.4倍。馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdAS-C表達水平顯著上升了2.8和2.7倍。

馬鈴薯甲蟲中，高水平表達的LdAS-C可能產生大量的AS-C蛋白，抑制JH的合成。測定JH合成關鍵酶：保幼激素酸甲基轉移酶LdJHAMT的轉錄水平。馬鈴薯甲蟲三齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2或5 d PBS處理葉片后，LdJHAMT表達水平顯著下降了64.0%和88.3%，以及63.2%和51.1% ；JH滴度顯著下降了78.2%和75.6%，以及78.9%和66.2%。馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲喂食1 ddsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片、2 d PBS處理葉片后，LdJHAMT表達水平顯著下降了69.1%和75.0%；JH滴度顯著下降了82.4%和88.8% 。圖4

注：相對表達量經qRT-PCR測定，每個生物學重復設置3個技術重復。20E的相對滴度通過(LC-MS/MS)系統檢測。JH的相對滴度通過LC-MSMS聯用測定。柱狀圖表示平均數±標準誤。柱頂不同的小寫字母表示在P< 0.05水平差異顯著

馬鈴薯甲蟲三齡幼蟲取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片后，其體內LdSHD的表達水平下降，20E滴度降低，LdFTZ-F1-1 轉錄本也大幅減少。圖5

注：相對表達量經qRT-PCR測定，每個生物學重復設置3個技術重復。20E的相對滴度通過(LC-MS/MS)系統檢測。JH的相對滴度通過LC-MSMS聯用測定。柱狀圖表示平均數±標準誤。柱頂不同的小寫字母表示在P< 0.05水平差異顯著

取食dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2處理葉片也抑制了馬鈴薯甲蟲幼蟲體內的20E信號轉導途徑。

2.3 dsLdATPaseE的劑量效應

研究表明，LdATPaseE的mRNA 水平、體重和化蛹率顯著下降，且下降幅度與使用劑量正相關。重要的是，dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2稀釋104倍后處理葉片，仍能顯著降低馬鈴薯甲蟲三齡幼蟲的化蛹率，而這一濃度僅相當于5 ng/mL的dsRNA濃度。圖6

注：5個不同濃度的dsE1(左欄)和dsE2(右欄)分別浸泡葉片飼喂試蟲1 d，隨后用PBS浸泡葉片飼喂試蟲2 d后，測定了試蟲的靶標基因表達量(A和B)、幼蟲體重(C和D)和化蛹率(E和F)。空白對照(CK)用PBS浸泡葉片、負對照(dsegfp)用最高濃度(即稀釋100倍的菌液)連續飼喂幼蟲3 d。柱狀圖表示平均數±標準誤。柱頂不同的小寫字母表示在P< 0.05水平差異顯著

LdATPaseE的mRNA 水平、體重和化蛹率的下降幅度也與使用劑量正相關。對LdATPaseE的mRNA 水平的最低有效濃度為稀釋104倍即dsRNA濃度為5 ng/mL。對體重影響的最低有效濃度為稀釋102倍即dsRNA濃度為500 ng/mL。對化蛹率影響的最低有效濃度為稀釋103倍即dsRNA濃度為50 ng/mL。圖7

注：5個不同濃度的dsE1(左欄)和dsE2(右欄)分別浸泡葉片飼喂試蟲1 d，隨后用PBS浸泡葉片飼喂試蟲2 d后，測定試蟲的靶標基因表達量(A和B)、幼蟲體重(C和D)和化蛹率(E和F)。空白對照(CK)用PBS浸泡葉片、負對照(dsegfp)用最高濃度(即稀釋100倍的菌液)連續飼喂幼蟲3 d。柱狀圖表示平均數± 標準誤。柱頂不同的小寫字母表示在P< 0.05差異顯著

3 討 論

vATPase是一個高度進化保守的古老跨膜轉運蛋白復合體，在真核生物中擁有多個重要的功能。研究在馬鈴薯甲蟲L.decemlineata中克隆并描述了囊泡型ATP酶E亞基(vATPase subunit E，LdATPaseE)的基因。在黑腹果蠅中，E亞基被單個基因編碼。系統發育的結果證明了ATPaseE亞基的蛋白質在昆蟲類群中形成一個大分支，而2個哺乳動物形成了一個小分支，該2支互相分開。這些結果表明，馬鈴薯甲蟲中的LdATPaseE與黑腹果蠅的ATPaseE為直系同源關系。

在昆蟲中，vATPases擔負腸道的營養吸收、馬氏管液體的分泌和卵母細胞的液體吸收等重要功能[21-22]。與vATPase的功能一致，結果表明，LdATPaseE在馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲腸道和馬氏管中表達量很高。

在一至三齡的幼蟲中，LdE75在蛻皮后出現高峰，在齡末期出現低谷。在四齡幼蟲中，LdATPaseE的最高峰出現在蛻皮后72 h，低谷出現在蛻皮后96 h。可見，在馬鈴薯甲蟲L.decemlineata中20E滴度的高峰和LdATPaseE的表達水平的低谷同時出現。20E的高峰抑制LdATPaseE的表達。

20E和蛻皮酮類似物氯蟲酰肼(Hal)在幼蟲末齡抑制了LdATPaseE的表達量。相反，喂食LdSHD和LdFTZ-F1的dsRNA降低20E的水平則上調了LdATPaseE的表達量。因此，20E的峰值抑制了LdATPaseE的表達。相反，取食JH及其類似物吡丙醚、敲低咽側體靜止激素基因LdAS-C[23]和保幼激素酸甲基轉移酶LdJHAMT[24]都不影響馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲體內LdATPaseE表達量。JH不參與調控LdATPaseE。

4 結 論

采用RNAi技術敲低LdATPaseE表達量不僅引起二齡幼蟲的死亡，而且影響三齡和四齡幼蟲的化蛹，可見馬鈴薯甲蟲三齡和四齡幼蟲對dsLdATPaseE非常敏感。對于三齡幼蟲，dsLdATPaseE1/dsLdATPaseE2稀釋104倍后處理葉片，仍能顯著降低馬鈴薯甲蟲的化蛹率，而這一濃度僅相當于5 ng/mL的dsRNA濃度。對于四齡幼蟲，對LdATPaseE的mRNA 水平的最低有效濃度為稀釋104倍即dsRNA濃度為5 ng/mL。對體重影響的最低有效濃度為稀釋102倍即dsRNA濃度為500 ng/mL。對化蛹率影響的最低有效濃度為稀釋103倍即dsRNA濃度為50 ng/mL。LdATPaseE是應用RNAi技術治理馬鈴薯甲蟲幼蟲的候選基因。

敲低LdATPaseE還顯著升高了LdInR與Ld4EBP的表達量，抑制一個蛻皮激素合成基因的轉錄，降低20E滴度和一個20E響應基因的表達。敲低2個LdE75亞型還抑制了一個JH合成酶基因的表達，降低了JH滴度，下調了一個JH早期響應基因的表達量。敲低LdATPaseE通過抑制IIS信號途徑，降低20E和JH的滴度、下調20E和JH信號而影響幼蟲生長和發育。

在馬鈴薯甲蟲四齡幼蟲階段，20E通過其信號轉導途徑抑制LdATPaseE的表達。