應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹果葉酒發(fā)酵工藝

雷 靜，陳 雅，廉葦佳，韓 琛，阿依加馬麗·加帕爾，任紅松

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆吐魯番 838000)

0 引 言

【研究意義】桑椹含有豐富的花青素、維生素、白藜蘆醇、礦物質(zhì)及微量元素等成分[1]。桑葉富含r-氨基丁酸、黃酮苷、生物堿、多糖等生物活性成分[2]，將兩者按照比例混合發(fā)酵得到桑椹果葉酒，產(chǎn)品不僅含有桑椹果實(shí)賦予的果香及生物活性物質(zhì)，還含有桑葉給予的功能性物質(zhì)，使酒的成分更加豐富，功效更加顯著[3,4]。桑椹漿果的收獲季節(jié)性強(qiáng),且在運(yùn)輸和儲藏過程中也極易受到外界環(huán)境的影響而腐敗變質(zhì)，桑椹通常被加工成果汁、果醋和果酒等產(chǎn)品。吐魯番地區(qū)是桑樹適宜生長的地區(qū)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有桑樹約2 466.6 hm2(3.7萬畝)，產(chǎn)量約2×104t，但對桑椹資源的加工利用程度尚不高，每年又有大量桑椹，桑椹加工果酒不僅充分利用桑資源，而且豐富了果酒市場，增加桑椹的附加值[5]。【前人研究進(jìn)展】李莉[6]利用鮮桑葉、枸杞、白酒調(diào)配出桑葉保健酒；馬慧等[7]利用桑椹和桑椹葉制作的桑椹葉果復(fù)合飲料；黃進(jìn)等[8]以桑椹為主要發(fā)酵原料，制備了發(fā)酵型桑椹果酒，研究雜醇油與生物胺的變化規(guī)律，對其工藝進(jìn)行了優(yōu)化；歐燕等[9]利用桑椹和草莓2種原料生產(chǎn)出了桑椹-草莓復(fù)合果酒；楊芳等[10,11]以桑椹為原料，制作桑椹果酒，測定其主要成分動態(tài)變化規(guī)律及香氣成分分析；吳繼軍等[12,13]檢測了桑椹汁發(fā)酵過程中其糖類、有機(jī)酸、維生素等成分的變化；Wang等[14]研究了桑椹果酒在發(fā)酵過程中酚類化合物的動態(tài)變化。【本研究切入點(diǎn)】國內(nèi)外有關(guān)桑椹果酒發(fā)酵工藝研究的報道較多，而以桑椹和桑葉作為原料混合發(fā)酵果酒的工藝研究尚未見報道，有研究采用響應(yīng)面法，優(yōu)化桑椹果葉酒發(fā)酵工藝參數(shù)[15]。研究響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹果葉酒發(fā)酵工藝。【擬解決的關(guān)鍵問題】以黑桑椹和干桑葉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)及方差分析方法，分析影響桑椹果葉酒品質(zhì)顯著的因素，利用響應(yīng)面法分析各因素對桑椹果葉酒進(jìn)行感官評分。優(yōu)化桑椹果葉酒發(fā)酵工藝，確定工藝參數(shù)，為桑椹酒加工企業(yè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 黑桑椹

采摘于吐魯番高昌區(qū)園藝場；桑葉，采摘于吐魯番高昌區(qū)園藝場；白砂糖，新疆中唐糖業(yè)有限責(zé)任公司。

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇，均為分析純；NaHCO3、檸檬酸，均為食品級；果膠酶，上海康禧食品飲業(yè)有限公司；焦亞硫酸鉀，ESSECO S.R.L.；釀酒高活干酵母(LALVIN EC-1118)，上海杰兔工貿(mào)有限公司。

1.1.3 儀器

TP-A500型電子分析天平，美國康州HZ電子有限公司；UV754N紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；控溫發(fā)酵罐FJG-1、儲酒罐，吐魯番市耀揚(yáng)金屬制品有限公司；制冷設(shè)備ICA-20L，上海康賽制冷設(shè)備有限公司；打漿機(jī)DJ-330，溫州市龍灣東霸食品機(jī)械廠；酒精計(jì)；全自動電位滴定儀。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

黑桑椹：采摘于吐魯番高昌區(qū)園藝場，采摘后2 h之內(nèi)榨汁，加入二氧化硫靜止2 h，再加入果膠酶低溫靜止備用。

桑葉：桑葉采摘后洗凈，晾干，粉碎備用。

1.2.2 工藝流程

桑葉

↓

新鮮黑桑椹→分選→榨汁→加焦亞硫酸鉀→酶解處理→調(diào)節(jié)糖酸→接種酵母→控溫發(fā)酵→終止發(fā)酵→低溫澄清→倒灌→陳釀→澄清過濾→殺菌→灌裝→成品

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)1.2.3.1 不同采收期的桑葉對桑椹果葉酒品質(zhì)影響

以桑椹汁與桑葉質(zhì)量比為100∶1，初始糖度為22%、初始pH值為3.5、酵母接種量0.03%、發(fā)酵溫度18℃進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同采收期桑葉(春季桑葉、夏季桑葉、秋季桑葉、霜后桑葉)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.3.2 不同原料配比對桑椹果葉酒品質(zhì)影響

主要以桑椹汁、霜后桑葉為原料，初始糖度為22%、初始pH值為3.5、酵母接種量0.03%、發(fā)酵溫度18℃進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同配比原料(桑椹、桑葉質(zhì)量配比分別為20∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.3.3 不同初始糖度對桑椹果葉酒品質(zhì)影響

以桑椹汁與桑葉質(zhì)量比為100∶1、初始pH值為3.5、酵母接種量0.03%、發(fā)酵溫度18℃進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同初始糖度(18%、20%、22%、24%和26%)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.3.4 不同初始pH值對桑椹果葉酒品質(zhì)影響

以桑椹汁與桑葉質(zhì)量比為100∶1、初始糖度22%、酵母接種量0.03%、發(fā)酵溫度18℃進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同初始pH值(2.5、3.0、3.5、4.0和4.5)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.3.5 不同發(fā)酵溫度對桑椹果葉酒品質(zhì)影響

以桑椹汁與桑葉質(zhì)量比為100∶1、初始糖度22%、初始pH值為3.5、酵母接種量0.03%進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同發(fā)酵溫度(14、18、22、26和30℃)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.3.6 不同酵母接種量對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響

以桑椹汁與桑葉質(zhì)量比為100∶1、初始糖度22%、初始pH值為3.5、發(fā)酵溫度18℃進(jìn)行桑椹果葉酒發(fā)酵，研究不同酵母接種量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%)對桑椹果葉酒品質(zhì)的影響。

1.2.4 Box-Behnken中心組合

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選4個影響較大的因素，設(shè)置3個對桑椹果葉酒感官評分值影響較大的水平，建立4因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)[16]，以桑椹果葉酒感官評分為響應(yīng)值，各因素的3個水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼。表1

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Response surface factor levels

1.2.5 指標(biāo)測定1.2.5.1 酒精度、總糖、總酸

按照GB15038-2006的規(guī)定執(zhí)行[17]。

1.2.5.2 桑椹果葉酒感官評分評定標(biāo)準(zhǔn)

以色澤、澄清度、香氣、滋味、典型性5個方面為指標(biāo)，對桑椹果葉發(fā)酵酒的感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評價，滿分為100分。由10名品評人員組成品評小組，進(jìn)行感官評定，去掉1個最高分和1個最低分后，取其平均分作為感官評分(取小數(shù)點(diǎn)后1位)[18]。表2

表2 桑椹果葉酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of apricot wine

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel2007 統(tǒng)計(jì)分析，重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與回歸分析。通過Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 桑葉對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同采收期桑葉對桑椹果葉酒品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異，霜后桑葉發(fā)酵產(chǎn)品酒精度最高為12.2%vol，夏季桑葉發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度最低為11.5%vol，夏季桑葉發(fā)酵的產(chǎn)品感官評分最低為82.3分，霜后桑葉發(fā)酵的產(chǎn)品感官評分最高為90.3分。表3

表3 不同采收期桑葉下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 3 Effect of mulberry leaves at different harvest time on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.2 原料配比對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同原料配比發(fā)酵的產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異，原料配比200∶1發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度較高為12.2%vol，原料配比20∶1發(fā)酵產(chǎn)品的酒精度較低為10.8%vol，原料配比20∶1發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最低為79.3分，原料配比100∶1發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高為90.8分，原料配比20∶1發(fā)酵的桑椹果葉酒桑葉味較濃，不能體現(xiàn)桑椹的果香味。100∶1為較適宜的桑椹果葉酒原料配比。表4

表4 不同原料配比下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 4 Effect of different raw material ratio on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.3 初始糖度對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同初始糖度桑椹汁發(fā)酵的桑椹果葉酒品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異，初始糖度為18%的產(chǎn)品殘?zhí)亲畹蜑?.8 g/L，酒精發(fā)酵比較徹底，糖分大部分轉(zhuǎn)化為酒精，初始糖度為26%的產(chǎn)品殘?zhí)亲畹蜑?0.6 g/L，初始糖度為18%發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最低為83.8分，初始糖度為22%發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高為90.7分， 22%為發(fā)酵桑椹果葉酒較適宜的初始糖度。表5

表5 不同初始糖度下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 5 Effect of different initial sugar content on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.4 初始pH值對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同初始pH值桑椹汁發(fā)酵的桑椹果葉酒品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異， pH值為3.5的產(chǎn)品殘?zhí)亲畹蜑?2.1 g/L，酒精發(fā)酵情況較好，糖分幾乎轉(zhuǎn)化為酒精，pH值為2.5的桑椹果葉酒殘?zhí)亲罡邽?5.6 g/L，初始pH值2.5桑椹汁發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最低為78.5分，初始pH值3.5桑椹汁發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高為90.5分， pH值3.5為發(fā)酵桑椹果葉酒較適宜的初始pH值。表6

表6 不同初始pH值下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 6 Effect of initial pH value on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.5 發(fā)酵溫度對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同溫度發(fā)酵的桑椹果葉酒品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異，發(fā)酵溫度為14℃，發(fā)酵時間最長為13 d，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間最短為5 d，發(fā)酵溫度30℃發(fā)酵的桑椹果葉酒酸度最高，發(fā)酵溫度30℃發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最低為79.6分，發(fā)酵溫度18℃發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高為90.8分，18℃為發(fā)酵桑椹果葉酒較適宜的發(fā)酵溫度。表7

表7 不同發(fā)酵溫度下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 7 Effect of fermentation temperature on the quality of mulberry leaf fermented wine

2.1.6 酵母接種量對桑椹果葉酒的品質(zhì)影響

研究表明，不同酵母接種量發(fā)酵的桑椹果葉酒品質(zhì)指標(biāo)具有顯著性差異，酵母接種量為0.01%，發(fā)酵時間最長為11 d，酵母接種量為0.05%，發(fā)酵時間最短為7 d，酵母接種量為0.01%發(fā)酵的產(chǎn)品殘?zhí)亲罡邽?0.5 g/L，酵母接種量為0.03%發(fā)酵的產(chǎn)品殘?zhí)亲畹蜑?1.3 g/L，酵母接種量為0.01%發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最低為78.6分，酵母接種量為0.03%發(fā)酵產(chǎn)品的感官評分最高為91.0分， 0.03%為發(fā)酵桑椹果葉酒較適宜的酵母接種量。表8

表8 不同酵母接種量下桑椹果葉酒的品質(zhì)變化Table 8 Effect of inoculum on the quality of mulberry fermented wine

2.2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)

2.2.1 響應(yīng)面

各因素對桑椹果葉酒感官評分指標(biāo)的影響大小依次為發(fā)酵溫度﹥初始pH值﹥原料配比﹥初始糖度﹥酵母接種量，以桑椹果葉酒感官評分為響應(yīng)值(Y)，以原料配比(A)、初始糖度(B)、初始pH值(C)和發(fā)酵溫度(D)為自變量，建立4因素3水平中心組合實(shí)驗(yàn)，共包括29個實(shí)驗(yàn)方案，其中24個析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)，5個中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，用以計(jì)算實(shí)驗(yàn)誤差。表9

表9 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 9 Response surface methodology and results

2.2.2 回歸方程擬合及方差

對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=91.36+0.37A-0.198B+1.02C-1.56D+0.45AB-0.43AC-0.67AD+0.33BC-0.25BD+0.90CB-2.96A2-1.85B2-2.53C2-3.02D2

F模型=67.60，P模<0.000 1，擬合獲得的模型方程極顯著，回歸模型與實(shí)測值擬合程度好，可用該回歸方程替代實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對結(jié)果進(jìn)行分析。F失擬=3.57，P失擬=0.115 9>0.05，失擬項(xiàng)不顯著。模型中A、C、D的P值<0.01表現(xiàn)為差異極顯著，初始pH值、發(fā)酵溫度、原料配比對桑椹果葉酒感官評分的影響極其顯著，各因素影響感官評分順序?yàn)榘l(fā)酵溫度﹥初始pH值﹥原料配比﹥初始糖度。 A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，A2、B2、C2、D2對桑椹果葉酒感官評分的影響極其顯著。交互項(xiàng)AD、CD的P值都小于0.01，AD、CD對桑椹果葉酒感官評分的影響極其顯著。交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD的P值均大于0.05，對桑椹果葉酒感官評分影響不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.985 4，校正決定系數(shù)是0.970 8。

表10 回歸模型及方差Table 10 Regression model and analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面圖

研究表明，隨著原料配、初始糖度、初始pH值、發(fā)酵溫度由水平-1向+1變化時，桑椹果葉酒感官評分出現(xiàn)先增大后減小的趨勢。原料配比、初始糖度、初始pH值和發(fā)酵溫度之間的交互作用對感官評分的影響程度。圖1

圖1 各因素交互作用響應(yīng)曲面Fig.1 The interaction of various factors in response to the surface diagram

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

最適桑椹果葉酒發(fā)酵工藝條件為原料配比103.64、發(fā)酵溫度17.04℃、 初始pH值3.59、 初始糖度21.83%。將工藝條件調(diào)整為原料配比103.5∶1、發(fā)酵溫度17.0℃、 初始pH值3.6、 初始糖度21.8%。桑椹果葉酒感官評分的平均值為91.5分。

3 討 論

選擇霜后桑葉發(fā)酵桑椹果葉酒較適宜[19]。隨著初始糖度的增加，酒精度逐漸升高。這主要是因?yàn)榫凭l(fā)酵主要依靠糖來轉(zhuǎn)化為酒精，糖度含量越高，酒精度越高[20]，對時間的影響主要是因?yàn)樯ｉ┲膒H值太低影響酵母活性，抑制發(fā)酵過程，使發(fā)酵周期明顯延長[21]；響應(yīng)面越陡峭，兩因素間的交互作用越明顯[18]，原料配比和發(fā)酵溫度的交互作用與初始pH值和發(fā)酵溫度的交互作用對桑椹果葉酒感官評分的影響顯著，其余因素間交互作用影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致[22,23]。

原料是保證果酒產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素之一，它將直接影響果酒釀造后的品質(zhì)[24]。研究采用桑椹果實(shí)和桑葉為主要原料混合發(fā)酵制得桑椹果葉酒，桑葉中含有酚類、生物堿、氨基酸、多糖、微量元素等營養(yǎng)和生物活性成分，其中桑葉中的r-氨基丁酸(GABA)含量較高，一種強(qiáng)神經(jīng)抑制性氨基酸，桑葉還含有1-脫氧野尻霉素(DNJ)天然生物堿成分，它是一種a-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖的功效，因桑葉豐富的營養(yǎng)價值，有關(guān)于桑葉茶、桑葉飲料等功能性食品的研究，桑椹桑葉混合發(fā)酵研究方面，王藝霖[4]研究了不同比例的桑葉添加量對桑椹桑葉發(fā)酵酒中酚類，生物堿，氨基酸等成分含量的影響，最終選定2%的桑葉粉添加量為混合發(fā)酵酒的較合適添加量。

桑椹果葉酒在發(fā)酵過程受到原料配比、酵母菌種、發(fā)酵溫度、初始糖度、初始pH值、初始SO2濃度、酵母接種量、發(fā)酵時間等多種因素的影響[25]，這些因素直接或間接的影響酒的色澤、香氣、口感等感官品質(zhì)。該研究在前期研究中，對不同時節(jié)的干桑葉、原料配比、初始糖度、初始pH值、酵母接種量、發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，后篩選出原料配比、初始糖度、初始pH值、發(fā)酵溫度對桑椹果葉酒感官評分的影響較大的4個因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。葉學(xué)林[26]等采用桑椹為主要原料，以感官評分為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹果酒發(fā)酵工藝，得到起始糖度22.6%，起始pH 3.6，主發(fā)酵溫度15℃，這與試驗(yàn)中選擇的這3個指標(biāo)的研究結(jié)果基本一致，這主要是因?yàn)樯ｉ┕~酒的主要原料為桑椹，桑葉的比例占得較小，低溫發(fā)酵能夠較好的保持桑椹酒的果香及色澤，整個發(fā)酵過程兩者差別不大。而與范玉婷[3]、任博[18]等以桑椹為原料優(yōu)化桑椹酒工藝，得出最優(yōu)發(fā)酵溫度為25℃，這與試驗(yàn)中發(fā)酵溫度指標(biāo)的研究結(jié)果不一致，這主要是因?yàn)椴煌脑希煌陌l(fā)酵環(huán)境，及研究者的評判標(biāo)準(zhǔn)不一致。

4 結(jié) 論

通過以桑椹果葉酒感官評分為響應(yīng)值(Y)，原料配比(A)、初始糖度(B)、初始pH值(C)和發(fā)酵溫度(D)為自變量建立回歸方程：Y=91.36+0.37A-0.198B+1.02C-1.56D+0.45AB-0.43。

AC-0.67AD+0.33BC-0.25BD+0.90CB-2.96A2-1.85B2-2.53C2-3.02D2，得到最適桑椹果葉酒發(fā)酵工藝條件為原料配比103.64、發(fā)酵溫度17.04℃、 初始pH值3.59、 初始糖度21.83%，在此條件下的桑椹果葉酒感官評分最大理論值為91.63分。實(shí)際測得桑椹果葉酒感官評分的平均值為91.5分，實(shí)驗(yàn)值與模型回歸值一致性良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型分析、預(yù)測各因素對桑椹果葉酒感官評分值的影響。該回歸模型具有較好的預(yù)測性能。