西洋參總皂苷對急性血瘀模型大鼠的作用研究

司雨，李樂，陳小玲，司函瑞，史大臻，劉金平，李平亞，焦玉鳳（吉林大學藥學院天然藥物研究中心，長春 130021）

心血管疾病是目前全球發病率和死亡率最高的疾病之一[1]。多種心腦血管疾病共同發展，會導致一種病理生理過程，即血瘀證，這是中醫臨床上常見的一種證候。瘀血是由于血液運行不暢凝聚于某一局部而形成的病理產物，導致許多新的病癥，血瘀證是瘀血引起的最典型的病證[2]。目前，研究最多的血瘀證模型有氣虛血瘀證[3-4]、氣滯血瘀證[5-6]、寒凝血瘀證[7-8]等。寒凝血瘀證又被稱為急性血瘀模型[9-10]，目前使用最廣泛的是采用冰水浴加皮下注射腎上腺素，其成功率較高，造模方法穩定，與臨床病癥結合度高，很好地驗證了中醫對于血瘀證“寒則凝，凝則成瘀”的理解[11]。有研究表明，血瘀證涉及多個復雜的病理生理變化，主要表現為血液流變學的變化[12-15]、凝血功能的異常[16]。血液流變學是流動性質與變形規律的科學，具有重要的臨床價值，已廣泛應用于許多疾病的診斷。凝血四項是評估溶栓治療的監測、臨床出血性或血栓性疾病、抗凝血藥物用量監控以及外科手術前凝血功能的重要指標。

西洋參（Panax quinquefoliumL.）系五加科（Araliaceae）人參屬，又稱花旗參，主產于加拿大魁北克、美國威斯康辛、中國吉林和山東等地[17]。西洋參性寒，以養陰生津作用為主[18]。西洋參主要含有皂苷類、糖類、揮發油類等活性成分，其中人參皂苷是其發揮藥理作用的主要活性物質。眾多研究表明西洋參總皂苷（PQS）具有豐富的藥理活性，主要體現在提高機體免疫力[19]、抗心肌缺血[20]、抗腫瘤[21]、降血糖[22]、降血脂[23]、改善認知[24]等方面。研究發現，西洋參及其活性成分對心血管疾病具有一定療效[25-27]。王寶君等[28]研究表明，西洋參莖葉總皂苷聯合氯吡格雷和阿司匹林干預急性心肌梗死（AMI）大鼠，對血管內皮功能有協同保護作用，并可改善大鼠AMI后心室重構，有進一步抑制血小板聚集和血栓形成的趨勢。于遠航等[29]研究發現，參七湯（西洋參、三七）可干預促進皮冠狀動脈介入治療（PCI）術后患者的血清白細胞介素10（IL-10）、轉化生長因子β1（TGF-β1）的合成，從而促進血管內皮修復，進而有利于心臟康復。但鮮有研究報道PQS的抗血瘀活性。本實驗首次探討了PQS對急性血瘀模型大鼠血液流變學及血漿中α顆粒膜蛋白（GMP-140）、血管性血友病因子（vWF）的影響，為西洋參用于心血管疾病的治療提供了實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康Wistar雄性大鼠60只，體質量180～220 g [長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，質量合格證號：SCXK（吉）-2020-0008]。

1.2 試藥

新鮮西洋參根于2018年10月采集于吉林省敦化市，經吉林大學藥學院天然藥物研究中心李平亞教授鑒定為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的根。取西洋參藥材，用粉碎機粗打，取粗料10 kg，在小型多功能提取罐中，以80%乙醇加熱提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇至無醇味，加水稀釋至10 L，過濾，濾液上D101大孔吸附樹脂，用蒸餾水洗脫至無色，繼續用95% 乙醇洗脫至Molish反應為陰性，減壓濃縮，除去乙醇，蒸餾水稀釋后微孔濾膜過濾，冷凍干燥，得PQS（純度為75.28%），備用。

腦心通膠囊（規格：0.4 g/粒，陜西步長制藥有限公司，批號：171269）；鹽酸腎上腺素注射液（規格：10 mL/支，遂成藥業股份有限公司，批號：51767172）；水合氯醛（分析純，北京化工廠，批號：B0601012）；大鼠血漿GMP-140 ELISA檢測試劑盒、大鼠vWF ELISA 檢測試劑盒（長春鼎國生物技術有限責任公司的R＆D Systems分裝試劑盒）；Sysmex-凝血試劑（日本希森美康株式會社）。

1.3 儀器

FA1104N型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；TGL-16aR型超高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；TECAN SUNRISE 酶標儀（瑞士帝肯公司）；KES-900B型血流變檢測儀（無錫康爾生儀器公司）；CA-50血凝儀（日本希森美康株式會社）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

取PQS粉末，用蒸餾水配成質量濃度為高（40 mg·mL－1）、中（20 mg·mL－1）、低（10 mg·mL－1）3個劑量的供試藥液。

Wistar大鼠適應性飼養一周，飼養條件為室溫（22±2）℃，濕度40%～60%。該實驗獲吉林大學動物管理委員會（IACUC）的批準。將大鼠按體質量隨機分為6組，每組10只，包括正常對照組，模型組，PQS高（400 mg·kg－1）、中（200 mg·kg－1）、低（100 mg·kg－1）劑量組和陽性對照組（腦通靈200 mg·kg－1）。每日上午9點灌胃給藥，每日1次，連續8 d。

2.2 急性血瘀模型大鼠的制備

除正常組大鼠外，其他組大鼠每次灌胃給藥30 min后，置于冰水混合物中（0～1℃）游泳6 min，連續7 d，并于第8日后，皮下注射0.1%腎上腺素0.8 mL·kg－1，共兩次，中間間隔2 h，用以制備急性血瘀模型[30-32]。

2.3 血液流變學指標的測定

大鼠末次注射腎上腺素后，禁食不禁水過夜，第9日末次灌胃給藥40 min后，腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg－1麻醉大鼠[32]，腹主動脈取血。取1 mL全血置于血流變檢測儀，測定全血低切（20·s－1）、中切（60·s－1）及高切（150·s－1）黏度，剩余全血3000 r·min－1，離心10 min，取上層血漿1 mL進行血漿黏度測定（140·s－1）。檢測應在采血后3 h內全部完成。測定過程中，使用肝素化試管抗凝。

2.4 血漿抗凝實驗

取抗凝管中血液2 mL，于25℃下3000 r·min－1離心 10 min。采用CA-50血凝儀及配套試劑，嚴格按照說明進行操作，測定上層血漿凝血四項，即凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶原時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原含量（FIB）。

2.5 血漿GMP-140蛋白及vWF含量的測定

將抗凝管中的血液在3000 r·min－1離心20 min，吸取上層血漿分別按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，測定大鼠血漿GMP-140及vWF的含量。

2.6 統計方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行處理，實驗結果以均數±標準差（±s）表示，組間統計分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PQS對急性血瘀模型大鼠血液流變學的影響

由表1可知，與正常對照組比較，模型組的全血低、中、高切黏度、血漿黏度及紅細胞聚集數明顯增加（P＜0.01），即為模型成功大鼠。與模型組比較，PQS低、中、高劑量組大鼠全血低、中、高切黏度、血漿黏度和紅細胞聚集數顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明PQS有明顯改善急性血瘀模型大鼠的血液流變學作用；陽性對照組可使急性血瘀模型大鼠血液流變學指標顯著降低（P＜0.01）。

表1 PQS對血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of PQS on whole blood viscosity and plasma viscosity in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表1 PQS對血瘀模型大鼠全血黏度及血漿黏度的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of PQS on whole blood viscosity and plasma viscosity in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 給藥劑量/（mg·kg－1）全血黏度/（mPa·s） 血漿黏度/（mPa·s－1） 紅細胞聚集數20·s－1 60·s－1 150·s－1正常對照組 － 8.31±0.28 6.26±0.16 4.48±0.32 1.12±0.23 1.31±0.14模型組 － 12.31±0.26## 8.24±0.21## 6.60±0.28## 1.81±0.31## 1.53±0.28##PQS給藥組 100 10.31±0.59* 6.78±0.59* 4.78±0.42* 1.69±0.10* 1.49±0.21 200 9.52±0.54** 6.36±0.42** 4.61±0.16** 1.59±0.08** 1.42±0.29**400 9.86±0.64** 6.48±0.26** 4.68±0.26** 1.62±0.21** 1.45±0.33*陽性對照組 200 9.42±0.41** 6.28±0.36** 4.56±0.2** 1.54±0.21** 1.39±0.31**

3.2 PQS對急性血瘀模型大鼠凝血功能的影響

由表2可知，與正常對照組比較，模型組PT、APTT和TT顯著減少，FIB顯著增高（P＜0.01），表明模型組凝血功能被明顯激活，即為造模成功。與模型組比較，PQS低、中、高劑量組，均明顯延長PT、APTT 和 TT，明顯降低FIB（P＜0.05，P＜0.01）。且高劑量組的效果與陽性對照組接近，表明PQS可顯著改善急性血瘀大鼠凝血指標，具有明顯的活血化瘀作用。

表2 PQS對血瘀模型大鼠凝血四項指標的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of PQS on the coagulation factors in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表2 PQS對血瘀模型大鼠凝血四項指標的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of PQS on the coagulation factors in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

凝血功能指標APTT/s TT/s PT/s FIB/（g·L－1）正常對照組 － 23.41±2.88 21.14±1.21 29.24±4.67 1.68±0.32模型組 － 16.33±2.13## 14.19±1.01## 21.87±3.69## 5.01±0.66##PQS給藥組 100 18.24±3.12 17.15±0.29 23.62±3.98 4.32±0.62 200 19.43±4.02* 18.08±0.88* 24.92±4.01* 3.82±0.51*400 20.65±2.62** 18.98±0.62** 26.52±5.66** 3.04±0.03**陽性對照組 200 21.68±0.44** 19.32±0.89** 27.66±2.82** 2.69±0.23**組別 劑量/（mg·kg－1）

3.3 PQS對血漿GMP-140及vWF含量的影響

由表3可知，與正常對照組比較，模型組大鼠血漿GMP-140及vWF含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，PQS低、中、高劑量組可使模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.001），其中中劑量組最為顯著；陽性對照組可使模型大鼠血漿GMP-140及vWF水平明顯降低（P＜0.01）。

表3 PQS對血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of PQS on the content of GMP-140 and vWF in rats with blood stasis (±s，n＝10)

表3 PQS對血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of PQS on the content of GMP-140 and vWF in rats with blood stasis (±s，n＝10)

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

vWF/（pg·mL－1）正常對照組 － 6.5±0.1 626±62模型組 － 10.5±0.4## 1066±159##PQS給藥組 100 8.8±0.9* 971±52*200 7.7±0.8** 789±148**400 8.3±0.1** 811±65**陽性對照組 200 7.4±0.8** 766±65**組別 給藥劑量/（mg·kg－1）GMP-140/（ng·mL－1）

4 討論

近年來，由于人們飲食作息不規律以及工作強度較大，導致血瘀體質的群體增多，因此對于血瘀證和促進血液循環，活血祛瘀等研究日漸深入。血瘀證涉及血管堵塞，從而影響血管循環，與多重疾病的發生都有關聯，比如心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等[33]。

皂苷是一類結構相對復雜的化合物，主要包括三萜皂苷和甾體皂苷，生物活性較高。大量研究表明，皂苷類組分對血瘀證的作用顯著，主要從血液流變學、血瘀高凝狀態的改善等方面起到活血化瘀作用[34-35]。PQS是從西洋參根部提取的皂苷類成分，王蕾等[36]認為，PQS具有緩解冠心病患者心肌缺血癥狀、改善心功能缺血的功能。鞠傳靜等[37]認為，西洋參葉二醇組皂苷可能通過改善心室重構大鼠的左心收縮和舒張功能發揮防治心室重構的作用。在中醫理論中，過勞過寒有傷形體。本研究在復制急性血瘀大鼠模型時，將大鼠置于冰水混合物中（0～1℃）6 min，逐漸使其過勞過寒。研究中采用的急性血瘀模型的方法與傳統血瘀模型制備方法相比，具有死亡率低，造模成功率高等有優點。氣行則血行，氣虛則血滯。急性血瘀大鼠模型的血液流變學及血小板聚集等指標發生改變[38]，具有“濃、黏、凝、聚”的特點。

血液流變學作為主要研究循環血液的流動性、變形性、凝固性及其成分流動、變形規律的科學[39]，其指標出現異常，會引起機體血液循環障礙，從而導致血栓的形成，而全血黏度和血漿黏度則是反應血液流變性質的重要指標。高剪切率（150·s－1）下的血液黏度可反映紅細胞的變形能力；中剪切率（60·s－1）下的血液黏度反映紅細胞解聚后無變形時的水平變化；低切變率（20·s－1）下的血液黏度則反映紅細胞聚集能力[40-41]。本研究血液流變學指標顯示，PQS 100、200、400 mg·kg－1三個濃度均能顯著降低急性血瘀模型大鼠全血黏度、血漿黏度、全血還原黏度及紅細胞聚集指數，增強紅細胞變形能力，改善血液流變性，使得血液便于流動，可初步證明其能改善急性血瘀狀態。

凝血四項（PT、TT、APTT、FIB）是判斷機體止血與凝血系統病理變化的重要指標，也是臨床上診斷血瘀最必要的檢查項目。PT用于檢測外源性凝血系統，其延長可客觀反映多種凝血因子的含量降低[42]；TT用于檢測內、外源性凝血途徑的共同凝血途徑[43]；APTT用于檢測內源性凝血途徑，APTT的縮短可客觀反映含有促凝物質或凝血因子活性增高[44]；FIB可表示纖維蛋白原的數量，其分子容易彎曲，引起分子間牽連，其量越多，高切率下的全血黏度越高[45]。當機體PT、TT、APTT等縮短，FIB延長，可激發內源性、外源性凝血系統活性，導致凝血功能紊亂，引起血小板聚集，血漿黏度增高，從而形成血栓。本研究凝血功能指標顯示，與模型組相比，PQS 200、400 mg·kg－1給藥后PT、TT、APT顯著延長，FIB顯著縮短。中、高劑量PQS可通過作用于外源性凝血系統、內源性凝血系統以及血小板系統，減少血凝過程和血小板聚集，改善血瘀癥狀。

GMP-140又稱P-選擇素，是活化血小板的敏感分子標志物，常存在于血小板、內皮細胞的Weibel-palade小體及顆粒膜上[46]。當體內發生血栓時，血小板或內皮細胞活化，GMP-140可迅速在血小板質膜上表達，介導單核細胞、中性粒細胞與活化血小板的結合[47]。vWF是血栓形成和止血過程中常見的糖蛋白，也是一種眾所周知的反應血管內皮損傷的指標[48]。vWF參與調節血小板黏附到血管壁過程，當血管內膜粥樣斑塊破裂，內皮細胞下基質中的膠原暴露，與大量的vWF結合，形成血栓。本研究結果表明PQS有明顯降低血瘀模型大鼠血漿GMP-140及vWF含量的作用，從而減少血小板活化，導致了血液流變學的改變。

綜上所述，本實驗從血液流變學、凝血功能和血小板相關蛋白方面探討PQS改善急性血瘀癥狀，從降低血液黏度、抑制血小板活化和黏附聚集、抑制血栓形成等方面進行驗證，為PQS抗血瘀的藥理作用提供了有力的科學依據，但其抗血瘀的具體機制尚有待進一步研究。