阿司匹林與氯吡格雷代謝相關基因多態性現狀分析及對缺血性腦卒中復發的影響

錢鳳丹，高岸，汪碩聞，周佳純，李琴，范國榮（上海交通大學附屬第一人民醫院臨床藥學科，上海 200080）

目前，腦卒中已成為全球范圍內第二大死亡原因[1]，而缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占70%[2]。在首次發生IS后，及時給予抗血小板藥物作為二級預防，可減少缺血性腦卒中的復發，降低致殘率和致死率。阿司匹林、氯吡格雷作為IS急性期治療及二級預防的抗血小板藥物，已被臨床廣泛推薦使用[3-5]。然而，由于個體差異，不同人群對抗血小板藥物的敏感性不同，即使規范地使用抗血小板藥物治療，臨床上每年仍有不少卒中再發事件。患者藥物基因代謝的位點發生雜合或純合突變可能引起藥物敏感性降低，即發生阿司匹林抵抗或氯吡格雷抵抗，從而引起藥效下降，抗血小板聚集不充分，導致缺血性事件發生[6-7]。本研究同時分析IS患者中阿司匹林和氯吡格雷兩藥多個基因位點多態性分布的特點，并隨訪患者一年內IS的復發情況，以期為IS二級預防的精準用藥提供參考。

1 儀器與試藥

TL988A型熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）。核酸純化試劑[商品名：耀金保，主要成分：60%聚乙二醇200（PEG200）、20 mmol·L－1KOH 和去離子水]；第一類體外診斷試劑、測序反應通用試劑盒（北京華夏時代基因科技發展有限公司）。TL988A型熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）。

2 方法

2.1 研究對象

本研究共納入2017年3月至2019年3月在本院神經內科住院，確診為IS的300名患者，行阿司匹林和氯吡格雷代謝相關位點的基因檢測。納入標準：隨機選取2017年3月至2019年3月，在上海市第一人民醫院神經內科住院，經顱腦核磁共振成像（MRI）確診為IS，年齡＞18歲，長期接受阿司匹林和/或氯吡格雷抗血小板治療（≥1年），并同時行阿司匹林和氯吡格雷代謝相關基因檢測的病例。排除標準：心源型缺血性腦卒中、腦出血史、動脈瘤、腦血管畸形等先天性疾病、急性消化道潰瘍或消化道出血病史可能無法堅持長期服用抗血小板藥物、有其他抗血小板治療禁忌證、未同時檢測阿司匹林和氯吡格雷代謝相關基因位點的患者，以及用藥依從性較差的患者。

2.2 基因分型

采集患者外周靜脈血血標本 2～3 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝真空管中，按測序反應通用試劑盒采用熒光染色原位雜交分析技術進行基因型檢測。放入熒光檢測儀中進行檢測；由熒光染色原位雜交分析系統自動判讀對應的熒光信號值，得到熒光曲線圖，進行基因分型，同時作陽性質控。

2.3 統計分析

計量資料采用IBM SPSS 24.0軟件進行各項數據統計分析。計算入組對象每個基因位點等位基因百分比，對研究對象Hardy-Weinberg遺傳平衡（H-W平衡）[8]的符合程度進行χ2檢驗，P＞0.05代表入組的樣本符合遺傳平衡；P＜0.05時，說明樣本發生偏倚，需剔除。

組間差異采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。使用IBM SPSS Statistics 24軟件進行統計，分析終點事件IS復發與患者臨床特征的相關性。單因素分析和多因素分析均使用SPSS的Binary Logistic回歸；多因素分析通過建立Logit概率方程式，分析與IS復發的影響因素。

2.4 患者隨訪

患者出院時，根據醫師是否采納阿司匹林和氯吡格雷基因檢測結果選擇藥物治療方案，分為采納建議組和未采納建議組。

采納建議組的用藥情況包括：① 阿司匹林和氯吡格雷基因檢測結果顯示無基因突變或等位基因缺失者，隨機選擇阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療；② 阿司匹林基因檢測結果提示基因突變或等位基因缺失，氯吡格雷未突變者，選擇氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療；③ 氯吡格雷基因檢測結果提示基因突變或等位基因缺失，阿司匹林未突變者，選擇阿司匹林100 mg，每日一次單藥治療；④ 阿司匹林和氯吡格雷基因檢測結果顯示均存在基因突變或等位基因缺失者，更換為西洛他唑50 mg，每日兩次治療。

未采納建議組的用藥情況：醫師不參考基因檢測結果，隨機為患者選擇阿司匹林100 mg，每日一次或氯吡格雷75 mg，每日一次單藥治療。

隨訪指標即主要終點事件：由MRI明確診斷為新發IS或者短暫性腦缺血復發；次要終點事件為死亡，隨訪期為1年。

3 結果

3.1 患者的基本臨床特征

入組的300名IS患者中基本臨床特征見表1。可見上海地區IS男性發病率高于女性；＞60歲的發病率高于60歲以下人群；體質指數（BMI）≥24的占44.33%，即BMI偏高發生IS的風險較高；合并高血壓的231例（77%）、糖尿病109例（36.33%）、總膽固醇（CH）大于上限的33例（11%）、三酰甘油（TG）大于上限的108例（36%）、低密度脂蛋白（LDL）大于上限的87例（29%）、高密度脂蛋白（HDL）低于下限的144例（48%）、脂蛋白a[Lpo（a）]大于上限的89例（29.67%）、高同型半胱氨酸血癥（HCY）99例（33%）、低葉酸水平153例（51%）、頸動脈狹窄195例（65%）。

表1 300例缺血性腦卒中患者的基本臨床特征Tab 1 Clinical data of 300 patiants with ischemic stroke

3.2 符合H-W平衡的阿司匹林和氯吡格雷相關基因代謝位點基因分布

根據H-W平衡檢驗結果，PEAR1、PTGS1、GP1BA的P＞0.05，說明群體基因遺傳平衡。GPIIIaP1A2的P＜0.05，可能與近交、種群結構、基因分型有關聯性，不符合H-W平衡，需剔除。由表2可見，上海地區IS患者PEAR1的GG型為121例（40.33%），GA型129例（43.00%）；PTGS1的GG型為299例（占99.67%）。GP1BA的CC型為264例（占88.00%）。

表2 符合H-W平衡檢驗的阿司匹林相關基因代謝位點基因型和等位基因分布Tab 2 Genotype and allele distribution of aspirin-related gene metabolism loci in line with H-W test

根據H-W平衡檢驗結果，CYP2C19*2、CYP2C19*3的P＞0.05，說明群體基因遺傳平衡。CYP2C19*17的P＜0.05，可能與近交、種群結構、基因分型有關聯性，不符合H-W平衡，需剔除。由表3可見，上海地區IS患者CYP2C19*2的GG型為127例（占42.33%），GA型137例（占45.67%）；CYP2C19*3的GG型為268例（占89.33%）。

表3 符合H-W檢驗的氯吡格雷相關基因代謝位點基因型和等位基因分布Tab 3 Genotype and allele distribution of clopidogrel-related gene metabolism loci in line with H-W test

3.3 阿司匹林和氯吡格雷基因代謝位點基因型分布和等位基因分布的比較

由表4和表5可見，PTGS1與IS患者的基本臨床特征無相關性（P＞0.05）。PEAR1、GP1BA的基因和等位基因的分布頻率與性別、年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、葉酸水平及血管狹窄情況無相關性（P＞0.05）。但PEAR1的基因型在CH＞5.2 mmol·L－1的患者中分布有差異（P＜0.05）；等位基因Lpo（a）＞300 mg·L－1，HCY＞15 μmol·L－1的IS患者中分布有顯著差異（P＜0.05）。GP1BA的基因型在飲酒、CH＞5.2 mmol·L－1、LDL＞2.8 mmol·L－1的患者中分布有差異（P＜0.05）；等位基因在飲酒的IS患者中分布有差異（P＜0.05）。

表4 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者阿司匹林代謝相關基因位點基因型分布的比較[n(%)]Tab 4 Genotype distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [(n(%)]

表5 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者阿司匹林代謝相關基因位點等位基因分布的比較[n(%)]Tab 5 Alleles distribution of aspirin metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

由表6和表7可見，CYP2C19*2的基因型在伴有高脂血癥的IS患者中的分布有顯著差異（P＜0.05），等位基因分布頻率無相關性，與其余基礎臨床特征和伴發疾病均無相關性（P＞0.05）。CYP2C19*3的基因型分布在有腦卒中家族史、等位基因分布頻率在葉酸＜5.38 ng·mL－1的IS患者中有差異（P＜0.05），與其余基礎臨床特征和伴發疾病均無相關性（P＞0.05）。

表6 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者氯吡格雷代謝相關基因位點基因型分布的比較[n(%)]Tab 6 Genotype distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

表7 不同臨床特征的300例缺血性腦卒中患者氯吡格雷代謝相關基因位點等位基因分布的比較[n(%)]Tab 7 Allele distribution of clopidogrel metabolism-related gene in 300 ischemic stroke patients with different clinical characteristics [n(%)]

3.4 隨訪結果

患者出院后，二級預防用藥采納建議組177例，未采納建議組123例。由表8可知，采納建議組IS復發率顯著低于未采納建議組（14.12%vs32.52%，P＜0.001）。

表8 采納建議組與未采納建議組缺血性腦卒中復發的比較Tab 8 Recurrence of ischemic stroke patients between the adoption group and the non-adoption group

3.5 Logistic回歸分析

3.5.1 單因素分析 對組內25項變量進行Logistic回歸分析，初始變量結果見表9。300例IS患者中，單因素分析結果顯示是否采納基因檢測結果用藥、有無飲酒和有無糖尿病與IS的復發顯著相關。

表9 多元逐步回歸單因素分析Tab 9 Multiple stepwise regression analysis of single factors

3.5.2 多因素分析 多因素分析使用似然比檢驗逐步法的Logistic回歸擬合，得到方程為：Logit（P）＝ －1.059－1.010×采納＋0.702×糖尿病，由表10可知，300例IS患者中，是否采納基因檢測結果用藥和有無糖尿病與IS復發相關，根據比值比即OR（odds ratio）值，小于1的是保護因素，大于1是危險因素，所以未采納基因檢測結果用藥、有糖尿病是IS復發的危險因素。

表10 多元逐步回歸多因素分析Tab 10 Multiple factor stepwise regression analysis

4 討論

本研究對象為上海地區的IS患者，男性發病率是女性的2.53倍，發病高峰年齡為61～70歲。有77%的患者合并高血壓，36.33%的患者合并糖尿病，33%的患者合并高型半胱氨酸血癥，51%的患者葉酸水平低于正常值，65%的患者有頸動脈狹窄。

藥物基因多態性引起的個體化差異直接影響臨床的治療效果，如抗血小板不充分，IS復發。在美國每年約795 000例腦卒中患者中，有185 000例反復發作的，其中1/3到1/2的缺血性事件復發發生在抗血小板治療期間[9]。

國內外已有較多圍繞心腦血管疾病二級預防用藥的單一藥物的某個基因位點的多態性的相關研究[10-11]。而綜合阿司匹林和氯吡格雷兩種藥物、多個位點基因多態性檢測結果，選擇二級預防用藥的療效相關研究較少。

本研究中IS人群的PEAR1、PTGS1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3位點符合H-W平衡，基本能反映其在上海地區IS患者中的多態性分布。并發現，PEAR1的GG型和GA型分別占40.33%和43.00%，攜帶A等位基因的有179例，服用阿司匹林后更易發生血小板聚集[12]，抵抗風險增加；PTGS1的GG型占99.67%，阿司匹林抵抗風險較GA型和AA型增加；GP1BA的CC型占88.00%，阿司匹林抵抗風險較CT型和TT型增加，與楊秀峰等[13]的研究一致。

CYP2C19*2的GA型占45.67%，對CYP2C19的代謝表型起主要決定作用。有研究報道中國人群CYP2C19*2，*3的突變率遠高于歐洲、美洲國家和其他種族人群，與韓國和日本相近[14]。與白種人和非裔美國人人群相比，亞洲人的CYP2C19*2等位基因頻率顯著增高（13%vs18%vs30%）[15]，而CYP2C19*3的突變在亞洲人群中相較其他人群中的出現概率更高（10%vs＜1%）[16-17]。

根 據PEAR1、GP1BA、CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因型與等位基因的分布特點分析，血脂代謝異常的IS患者，其代謝水平可能與PEAR1和GP1BA的基因分型有關；HCY代謝水平可能與PEAR1的基因分型有關；飲酒的習慣可能與GP1BA的基因分型有關。伴有高脂血癥IS患者，其血脂代謝水平可能與CYP2C19*2的基因分型有關；而腦卒中家族史和患者的葉酸水平可能與CYP2C19*3的基因分型有關。因此，缺血性腦卒中患者，尤其有家族史的，在二級預防用藥的同時，需要保持良好的生活習慣，包括保持運動、均衡膳食，控制血脂水平，多食綠色蔬菜，適當補充葉酸。

本研究300例IS患者，在出院后規律服用阿司匹林或氯吡格雷作為二級預防用藥，采納基因檢測結果用藥組缺血性腦卒中復發的有25例，未采納組為40例，差異有統計學意義。即同時檢測阿司匹林、氯吡格雷代謝相關基因，并可更全面地優化IS給藥方案，并提高二級預防的療效，降低IS復發的風險。

同時，本研究也存在一定局限性：未納入其他一些干擾因素，如血管狹窄患者是否行介入治療；胃腸疾病患者是否在服用氯吡格雷的同時服用質子泵抑制劑，如奧美拉唑可降低氯吡格雷的有效性[18]；未納入血小板抑制率檢測[19]。希望未來能有更全面的研究方案得出更可靠的證據來為臨床提供參考。