肉雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

吉尚雷 ，劉 欣 ，2，劉立英 ，侯春雪 ，2，萬 玲 *

（1. 遼寧農業職業技術學院，遼寧營口115009；2. 北京大偉嘉生物技術股份有限公司，北京100085）

雞白痢沙門氏菌病最易感染3 周齡內的雛雞，能夠引起雛雞排白色稀糞，因呼吸困難或急性敗血癥而死亡，病死率較高[1-2]。成年雞主要感染生殖系統[3]，導致產蛋率下降、種蛋的受精率、孵化率及健雛率降低，嚴重時可引起死亡。雞白痢沙門氏菌病可進行水平傳播，也可通過種雞蛋垂直傳播[4]。近年來，雞白痢沙門氏菌的防控措施已經十分完善，發病情況呈下降趨勢。但是，由于抗生素使用的不規范，導致耐藥菌株不斷出現，不同地區耐藥性不盡相同，嚴重影響養雞業的健康發展[5-6]。

2019年9月至12月，從遼南地區多家疑似感染雞白痢沙門氏菌的肉雞養殖場采集樣品進行實驗室檢測，分離得到1株細菌，通過病原分離鑒定確定為沙門氏菌，并進行藥敏試驗，為該病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

病料采自遼南地區某肉雞場10日齡發病雛雞的小腸、肝臟組織。

1.1.2 試驗試劑

HE 瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）購自青島海博生物技術有限公司；藥敏試紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；染色液及其他常規試劑由遼寧動物健康養殖研究中心實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離培養

無菌操作分別采集病雛雞的小腸、肝臟組織1 g，加入到10 mL 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，37 ℃培養12 h，用于沙門氏菌選擇性增菌培養。用接種環蘸取菌液并在HE瓊脂培養基上進行劃線，37 ℃培養24 h，挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細菌生化試驗

挑取單個菌落，接種于生化反應管中，37 ℃孵育48 h后觀察結果。

1.2.3 PCR反應

按照DNA 提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，采用已發表的16S rRNA 通用引物，引物序列為：8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1540R：5'-AAGGAGG TGATCCAGCCGCA-3'，對分離菌株 16S rRNA 基因進行擴增，預期擴增DNA片段大小約為1 500 bp。

PCR 反應體系30 μL：2×PCR Mix 3.0 15 μL、DNA 模板2 μL、上下游引物各2 μL、無菌水9 μL。PCR反應條件：預變性94 ℃、10 min，變性94 ℃、5min，退火55 ℃、1 min，延伸72℃、1 min，35個循環，最后延伸72 ℃、10 min。

PCR 擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR 產物測序后在Gen Bank 數據庫中進行BLAST 比對，進一步確定分離菌株的種類。

1.2.4 藥敏試驗

采用紙片擴散法測定分離株對各藥物的敏感性。挑取將純培養的菌落放入營養肉湯中增菌，均勻涂布于培養基表面，在培養基表面放置藥物紙片，紙片之間距離2 cm，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑大小，判定對不同藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養與染色鏡檢結果（見圖1、圖2）

由圖1 可知，在病死雞的腸道分離到一株細菌，在HE瓊脂培養基上長出黑色菌落。

圖1 分離菌在HE瓊脂生長特性Fig.1 Growth morphology of isolate on HE medium

由圖2 可知，革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓的紅色短小陰性桿菌，初步鑒定為沙門氏菌。

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Morphology of isolate under the microscope

2.2 細菌生化試驗結果

分離菌株可以發酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，不發酵乳糖、蔗糖、麥芽糖。吲哚試驗和V-P試驗呈陰性反應，甲基紅試驗為陽性，符合沙門氏菌的生化特性。

2.3 分離菌PCR鑒定結果（見圖3）

由圖3 可知，提取分離菌基因組DNA 作為模板，利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增[7]，電泳檢測目的條帶大小與預期一致。測序后獲得目的片段大小為1 448 bp，將測序結果在NCBI網站上進行Blast比對，結果顯示分離菌株與基因庫收錄的其他沙門氏菌菌株序列同源性在98%以上，確定分離菌株為沙門氏菌。

圖3 細菌PCR擴增結果Fig.3 The PCR result of isolated strain

2.4 分離菌藥敏試驗結果（見表1）

由表1可知，該菌株對阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四環素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥。

表1 分離菌藥敏試驗結果Tab.1 Drug susceptibility test results of isolated strain

3 討論

沙門氏菌是1種人畜共患的細菌性疾病，約有2 500種血清型[8]。在世界范圍內，人類因食用含有沙門氏菌的禽類食品而引起中毒的事件時有發生[9]。對家禽產業影響最嚴重的是雞白痢沙門氏菌[10]。目前，針對沙門氏菌，凈化是最普遍的技術手段[11]。在歐洲，主要通過綜合控制養殖場、屠宰場和食品加工廠，實施畜禽監控、淘汰感染動物等一系列具體措施，來減少養殖業中的沙門氏菌[12]。受養殖規模、養殖品種、飼養管理、環境變化、免疫選擇等多種因素影響，我國家禽沙門氏菌病年年發生[13]。遼南地區養雞業在全省占有較大比重，散養戶和中小型養殖場占較大比重。部分養殖戶為降低成本、增加利潤，大量使用抗生素，導致雞白痢沙門氏菌不斷變異產生耐藥株。

本試驗對遼南地區疑似雞白痢沙門氏菌感染的病死雛雞進行檢測，最終確定分離菌為雞白痢沙門氏菌。本研究利用12 種抗生素進行藥敏試驗，分離細菌對阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四環素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥。不同地區分離出的沙門氏菌耐藥性不盡相同，可能與抗生素的種類、使用方法、藥濃度、使用次數等有關[14]。因此，臨床上應該根據藥敏試驗結果篩選的高度敏感藥物進行治療，并且制定科學合理的藥物使用制度，避免耐藥菌株的產生[15]。

4 結論

從遼南地區某肉雞場發病雛雞中成功分離、鑒定1 株雞白痢沙門氏菌。該菌株對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥；對阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感。本試驗為遼南地區雞白痢沙門氏菌的分布和耐藥性變遷提供參考。