云南某肉雞場滑液囊支原體血清學及病原學診斷

陶 杰，張敬寒，徐 思，劉宇權，劉艷麗，張以芳，鄒豐才，柴 俊*

（1. 云南農業大學動物醫學院，云南昆明650201；2. 墨江縣動物疫病預防控制中心，云南墨江654800；3. 墨江縣畜牧工作站，云南墨江654800）

禽支原體感染在世界上分布廣泛，雞群中感染水平較高，常見的有雞滑液囊支原體和雞毒支原體。近年來，雞滑液囊支原體發病率呈上升趨勢[1]，是由雞滑液囊支原體（Mycoplasmasynoviae，MS）感染引起，以跗關節滲出性的滑液囊膜炎和腱鞘滑膜炎為特點的慢性或急性傳染病[2]。各品種雞均易感染，以雛雞為首。流行病學調查顯示，在東歐、荷蘭、墨西哥、阿根廷均存在MS 感染[3-4]；美國商品蛋雞普遍感染[5]；西歐弗蘭德斯地區感染率達76.3%[6]。MS 一年四季均會發生，春、冬兩季比較常見，主要傳染源是病雞或存在隱性感染的雞[7]。MS 可以通過種雞蛋進行垂直傳播，也通過飼養人員攜帶、飲用水污染等因素進行直接或間接的水平傳播[8]。不同菌株的感染對雞致病性不盡相同[9]，能夠引起不同程度的亞臨床型上呼吸道感染、關節炎和傳染性滑膜炎，使雞的生長發育緩慢、雞肉品質下降，嚴重時會引起雞免疫系統的抑制[10]。雞場一旦發生該病，很難根除，給養殖場帶來難以估量的損失。現有云南昆明某雞場中的雞出現陸續癱瘓死亡，部分雞喜臥、站立不穩、腳墊增厚、跗關節明顯腫大（飛節和趾節較為嚴重）、用手觸摸有波動感，診斷疑似為MS 感染。本試驗通過病雞的臨床癥狀診斷、病理組織剖檢、血清平板凝集試驗、PCR 檢測、基因序列比對和同源性分析進行綜合診斷，最終確診為MS 感染，為進一步防控和凈化雞滑液囊支原體病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2019 年12 月采自云南昆明某肉雞養殖公司具有MS典型癥狀的病雞樣品3只。

1.1.2 試劑及耗材

TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2xEasyTaq PCR SuperMIX（tdge）均購自北京全式金生物技術有限公司。陽性參考菌株、滑液囊支原體平板凝集試驗抗原、陽性血清均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 試驗方法

1.2.1 血清平板凝集試驗

參照GB/T 17999.4—2008《血清平板凝集試驗》要求進行樣品的血清平板凝集試驗。

1.2.2 引物的合成

根據GenBank 中公開發表的MS 的基因序列，利用Oligo7設計1對引物，MS-F引物：AAATCAGGCTCGGGC CCT，MS-R 引物：AGTAACCGATCCGCTTAATGC，擴增片段374 bp，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

1.2.3 病料采集及DNA提取

無菌采集腫脹關節腔內的關節液滲出物和內容物、胸部龍骨旁干酪樣壞死物和增厚腳墊內容物，黏液用生理鹽水稀釋。按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 使用說明書提取DNA，共提取3 份DNA。

1.2.4 PCR檢測

利用MS 檢測引物MS-F、MS-R 對上述提取的DNA進 行 PCR 擴 增 。 PCR 反 應 體 系 25 μL：2×Easy TaqSuperMix（tdge）12.5 μL、sterile ddH2O 9.5 μL、上下游引物各 1 μL。1 號加 1 μL 陽性菌株 DNA；2 號加 1 μL 的ddH2O；3、4、5 號各加入 1 μL 的 DNA 模板。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，擴增35個循環；72 ℃延伸5 min。反應完成后把PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統上觀察結果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。

1.2.5 測序和核苷酸同源性分析

將膠回收產物送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。測序的結果在NCBI 數據庫中進行比對，使用DNAStar 軟件，對 3 株分離株（YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019）與 GenBank 中的 16 株 MS 參考毒株進行16S rRNA 核苷酸序列同源性分析。參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息Tab.1 Reference strain information

2 結果與分析

2.1 病雞臨床癥狀和病理變化（見圖1）

圖1 病雞病理變化Fig.1 Pathological changes in sick chickens

對病雞進行抗生素治療，效果不明顯，發病數量仍在增加。詢問免疫程序，1日齡接種馬立克病疫苗；4日齡接種傳染性支氣管炎疫苗；7、21 日齡接種新城疫疫苗；14、28日齡接種法氏囊疫苗。

所觀察的雞為2 只土雜雞、1 只瑤雞。由圖1 可知，臨床癥狀為病雞雞冠輕微萎縮呈蒼白色、羽毛混亂、消瘦脫水、常縮頭閉眼、行走時步態蹣跚；跗骨關節腫脹變粗（飛節和趾節較為嚴重）、用手觸摸有波動感、腳墊增厚嚴重、行走的姿態呈輕微的八字步、胸部的皮下組織發生腫脹。

病理變化：剖檢病雞腫脹的關節和腳掌末端，發現有大量黏稠的黃色膿液的流出、胸部觸摸明顯增厚、有壞死灶形成；剖檢病雞的腺胃，發現里面基本沒有內容物、看不到明顯的病理變化、脾腎等器官正常；剖檢病雞的氣管未發現出血點，只有少量黏液。

2.2 病雞血清平板凝集試驗結果（見圖2）

由圖2可知，經過血清平板凝集試驗檢測，3份血清陽性率為100%。

圖2 病雞平板凝集試驗結果Fig.2 Plate agglutination test results in sick chickens

2.3 PCR擴增結果（見圖3）

由圖3可知，在374 bp位置可見清晰、明亮的特異性條帶，與預期條帶相符。

2.4 同源性分析結果（見圖4）

圖3 PCR產物電泳結果Fig.3 The electrophoresis result of PCRproduct

對分離株 YNKM1-2019、YNKM2-2019、YNKM3-2019 與GenBank 中的16 株參考毒株進行序列同源性分析。由圖5 可知，YNKM1-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~99.6%，其中與MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 的同源性最高，為99.6%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。YNKM2-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~100%，其中與YNKM3-2019 的同源性最高，為100%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。YNKM3-2019 與16 株參考序列同源性為94.2%~99.6%，其中與MS01-KT880075、IRG2-C-08-KP659459、MSR815-JX233548、MSK-1-KC832817 四株的同源性最高，為99.6%，與K870-KJ606930 的同源性最低，為94.2%。

圖4 同源性分析結果Fig.4 Homology analysis results

3 討論

近年來，云南省內MS發病率較高，但對本病的病原分離鑒定和相關研究較少。目前還未研發出針對性的藥物，不能根除該病，只能控制雞群感染率，降低發病率[11]。MS感染確診的方法有病原分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法等。病原分離鑒定可靠性較高，培養后分離細菌進行瑞士染色，在油鏡下和培養基上觀察形態來確定[12]。血清學診斷常用的有血清平板凝集試驗、血凝抑制試驗、酶連免疫吸附試驗等[13]。臨床中常用PCR檢測法，該方法特異性強、敏感性高、耗時短、操作簡單、準確性高[14-15]。為確保試驗結果的準確性，最終需要使用多種檢測方法來確診。

本研究采用血清學方法和病原分離鑒定對云南昆明某肉雞場疑似感染MS的病雞進行診斷。首先進行血清平板凝集試驗，結果3份病料樣品均為陽性；然后從特征性病理變化的腫脹關節內容物中提取DNA 進行PCR 擴增，擴增產物電泳結果顯示，在374 bp 處有清晰的特異性條帶；最后將PCR產物回收后進行測序，結果與Genbank中下載的16條參考序列進行比對，再通過同源性分析發現其同源性在94.2%~99.6%之間，確診為MS。

4 結論

本試驗對疑似MS 感染的臨床病料，通過提取DNA、PCR 產物電泳結果顯示，清晰無雜帶即可快速診斷，為治療該病節省時間，此方法適合規模化養殖的防控和凈化監測。