液相色譜-串聯(lián)質譜法測定飼料中16 種氨基酸

賀習文，雷 浩，高勤葉，趙雪寧，溫 卉，馬 川

（陜西秦云農產品檢驗檢測股份有限公司，陜西渭南714000）

氨基酸是含有堿性氨基和酸性羧基的一類有機化合物，是構成生命體蛋白質的基本物質。蛋白質作為人體必需的營養(yǎng)物質，在人體內不能被直接利用，而是在胃腸道中經過多種消化酶的作用，將高分子蛋白質分解為低分子的氨基酸后被人體吸收[1]。氨基酸進入血液中與其輸出速度幾乎相等，使體內氨基酸代謝處于動態(tài)平衡。當攝入的蛋白質含量適宜時，蛋白質和氨基酸之間不斷合成和分解形成一種平衡，從而達到機體的營養(yǎng)平衡狀態(tài)。蛋白質突然增加或減少攝入量時，平衡機制會被破壞。如果持續(xù)時間過長，可能會導致體內抗體的死亡[2-3]。飼料作為畜禽動物攝入的食物，對其所含氨基酸含量的監(jiān)測至關重要。

檢測氨基酸的方法有氨基酸分析儀法[4-5]、毛細管電泳檢測紫外測定法、衍生-電位傳感法[6-7]、高效液相色譜法[8-10]等。氨基酸分析儀法最為常見，但分析時長在1 h以上、檢測效率低；毛細管電泳檢測紫外測定法存在精度低、檢測結果不準確的缺點；高效液相色譜法檢測時長較長、需要柱前衍生、操作步驟煩瑣。所以，建立一種能快捷準確的測定飼料中氨基酸含量的液相色譜-串聯(lián)質譜法迫在眉睫。目前，已有液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS）檢測食品和保健品中的氨基酸含量[11-16]。本研究建立能同時測定不同種類的飼料中16 種氨基酸的LC-MS 方法，為飼料中氨基酸含量的測定提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

UltiMate 3000 液相色譜系統(tǒng)（Thermo）、TSQ Quantiva質譜儀（Thermo）、MS205DU 十萬分之一天平（Mettler Toledo）、101-1A電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）、MTN-5800A 氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）、渦輪混合器。

1.2 試驗試劑

16種氨基酸標準溶液（100 nmol/mL）購自德國曼默博爾公司；鹽酸（優(yōu)級純）購自四川西隴科學有限公司；甲酸（色譜純）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；購自甲醇（色譜純）Sigma公司。

6 mol/L 鹽酸溶液：500 mL 鹽酸和 500 mL 等比例混合；0.1%甲酸溶液：移取1.0 mL 甲酸于1 000 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD 50×2.1 mm，1.9 μm；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；洗脫程序見表1。

表1 液相色譜洗脫程序Tab.1 Liquid chromatography elution program

1.3.2 質譜條件

離子源：可加熱電噴霧離子源（H-ESI）；掃描模式：正離子掃描；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣：35 psi；輔助氣：10 psi；離子傳輸管溫度：350 ℃；源溫度：300 ℃；16種氨基酸質譜多反應監(jiān)測（SRM）參數(shù)見表2。

1.3.3 標準工作溶液的配制

準確移取1.2 中的16 種氨基酸標準溶液1.0 mL 于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀釋并定容至刻度，配制成濃度為10 μmol/L的標準工作溶液。

1.3.4 樣品前處理

稱取試樣約100 mg，置于20 mL 水解管中，加入6 mol/L 的鹽酸溶液10.0 mL，于氮氣下充氮3 min，趕去管中空氣，加蓋；（110±2）℃的電熱鼓風干燥箱中水解24 h，取出冷卻，搖勻，使用快速定性濾紙過濾至另一10 mL 離心管中；量取0.1 mL樣液于55 ℃下氮氣吹干，按樣品中氨基酸含量，加入1~10 mL 的0.1%甲酸水溶液復溶，過0.22 μm 水相濾膜后上機測定，上機溶液中各氨基酸含量應與標準工作溶液相近。

2 結果與分析

2.1 前處理過程的確定

根據(jù)GB/T 18246—2019中的前處理過程，對部分操作進行適當優(yōu)化，經過試驗驗證，水解管不需在冷凍環(huán)境下進行充氮操作，只需用氮氣趕盡管中的空氣，因此直接將水解管置于氮氣下充氮3 min 即可；水解后分取的樣液僅為0.1 mL，可直接在氮氣下吹干，對實驗室內環(huán)境不會造成太大污染，樣液在氮氣下吹干后，使用適合質譜儀的0.1%甲酸水溶液進行復溶，能夠減小溶劑效應對試驗結果的干擾。

2.2 16種氨基酸的線性方程和檢出限（見表3）

將1.2 中的16 種氨基酸標準溶液稀釋成濃度在0.01~50.00 μmol/L 的標準系列溶液，上機進行測定，以標準溶液濃度作為橫坐標x（μmol/L），以峰面積作為縱坐標y建立標準曲線。由表3 可知，16 種氨基酸在0.01~50.00 μmol/L 范圍內線性良好，相關系數(shù)均大于0.990 0。

以3倍的性噪比（S/N）所對應的質量作為檢出限，結果顯示16種氨基酸所能達到的檢測低限為1~10 ng/g。

表3 16種氨基酸的線性方程和檢出限Tab.3 Linear equations and detection limits of 16 amino acids

2.3 16種氨基酸的重復性測試（見表4）

稱取同一樣品共6 份，按照1.3.4 前處理方法制備樣液，在試驗條件下進行測定，以出峰時間計算定性重復性，以氨基酸含量計算定量重復性。由表4可知，16種氨基酸的定性重復性在0.02%~0.12% 之間，定量重復性在0.11%~0.94%之間，表明方法具有較好的精密度。

2.4 16種氨基酸的回收率測試（見表5）

選用采購自美正公司的魚粉質控樣品，樣品中16種氨基酸的量值及其擴展不確定度均為已知，按前處理過程處理試樣，上機測定后計算回收率。由表5 可知，16 種氨基酸的回收率在97.3%~104.0%之間，實測結果與質控樣標示量值的相對偏差均在2.0%以下，表明方法回收率良好。

2.5 實際樣品測定結果

選用配合飼料、濃縮飼料、魚粉、肉粉等不同種類的樣品共8 份，采用GB/T 18246—2019 與本方法同時對8 份樣品中16種氨基酸進行測定，結果表明，16種氨基酸的相對偏差均在5%以內，證明本方法測得結果準確可靠。

表4 16種氨基酸的重復性測試（n=6）Tab.4 Repeatability test of 16 amino acids(n=6) 單位：%

表5 16種氨基酸的回收率測試Tab.5 Recovery rate test of 16 amino acids 單位：%

3 結論

研究基于液相色譜-串聯(lián)質譜儀定性準確、檢測效率高等特點，通過優(yōu)化樣品前處理過程和液相色譜-質譜條件，建立能夠同時測定飼料中16種氨基酸的檢測方法。本方法處理過程簡單、易操作，經試驗證實檢出限低、靈敏度高、精密度良好、回收率、準確度高。與檢測用時較長的氨基酸分析儀相比，能夠縮短分析時間、提高檢測效率。研究為飼料中16種常規(guī)氨基酸含量的檢測提供參考。