酶解豬血制備氨基酸液體肥工藝條件優化

蔡藝菲 ，趙鑫陽 ，田曉靜 ，2*，宋 禮 ，羅 麗 ，丁功濤 ，2，曹 竑 ，2，陳士恩 ，2

（1. 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730124；2. 西北民族大學生物醫學研究中心中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅蘭州730030；3. 甘南牦牛乳研究院，甘肅甘南747000）

我國年出欄生豬約7 億頭，屠宰生豬產生的副產物豬血約有200萬t[1]。豬血中含有大量的蛋白質和豐富的氨基酸，包括人體所必需的8 種氨基酸在內的18 種氨基酸，特別是賴氨酸、亮氨酸含量豐富[2]。豬血除少量直接食用外，其余豬血資源的利用率很低。血液排放后，極易腐爛變質，滋生大量微生物，導致水源污染和農田土質惡化等問題。用酶解法對豬血紅蛋白進行處理，可以有效提高血蛋白的利用率[3]。研究表明，可以利用酶解豬血血紅蛋白制備血紅素、螯合肽、抗氧化肽、氨基酸液體肥等[4-8]。液體肥料又稱流體肥料，是含有一種或多種農作物生長必需營養元素的液體肥。氨基酸是其主要成分之一。氨基酸液體肥生產成本低、高效、無污染。因此，研究豬血血紅蛋白的水解可以有效利用豬血，獲得巨大的經濟效益，同時緩解廢棄血液帶來的環境污染。目前，國內對利用酶解法水解豬血蛋白制備氨基酸液體肥的研究較少。因此，為了獲得更高效的水解工藝，本研究利用風味蛋白酶水解豬血中的蛋白，優化氨基酸液體肥的制備工藝的條件，研究較佳水解豬血蛋白的參數，為利用豬血生產氨基酸液體肥加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料與試劑：干燥豬血粉、風味蛋白酶、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、酚酞、乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀基準物質。

儀器：SL-1001電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、PHS-3C pH計（上海雷磁有限公司）、L3S可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、恒溫干燥箱（日本日立公司）、722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

新鮮豬血抗凝處理，真空冷凍干燥制成豬血粉。

1.2.2 總氮的測定

參照GB 5009.5—2016，采用分光光度計法測定總氮（Nt）的含量。采用分光光度計法測定總蛋白（TP）含量。

1.2.3 氨基態氮測定

參照GB 5009.235—2016中酸度計法測定氨基態氮（N0）。

1.2.4 水解率測定

用甲醛滴定法測氨基態氮含量，按下式計算水解率（DH）。

1.2.5 單因素試驗

以水解率為指標，通過單因素試驗研究料液比（1∶6、1∶7.5、1∶9、1∶10.5、1∶12 g/mL）、酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）、pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、溫度(40、45、50、55、60 ℃）和水解時間(2、3、4、5、6 h)對血液水解率的影響。

1.2.6 正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用5 因素3 水平正交試驗優化提取工藝，正交試驗因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factor level table of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對血液水解率的影響（見圖1）

圖1 料液比對血液水解率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on blood hydrolysis rate

豬血紅蛋白的水解率起初隨著底物質量濃度的增加而增加，之后水解率隨底物質量濃度的增加有所降低，即此時酶與底物結合達到飽和，底物質量濃度的增加不再提高反應效率，反而因底物濃度過大，降低酶在溶液中的擴散能力；另一方面，過量底物可能通過分子間作用力與酶結合形成中間產物，抑制酶解反應的進行，使得水解率降低[9]。在 pH 值7、酶濃度 8 000 U/g、溫度50 ℃、時間 4 h 的條件下，研究血液水解率隨料液比（1∶6.0、1∶7.5、1∶9.0、1∶10.5、1∶12.0 g/mL）的變化規律。由圖1 可知，料液比在1∶6.0~1∶7.5 g/mL 范圍內，血液水解率隨料液比的減小而減小。料液比在1∶7.5~1∶9.0 g/mL 范圍內，血液水解率隨料液比的減小而提高。料液比在1∶9.0~1∶10.5 g/mL 范圍內，血液水解率隨料液比的減小而降低。料液比在1∶10.5~1∶12.0 g/mL 范圍內，血液水解率隨料液比的減小而增大。在料液比為1∶9.0 g/mL 時，血液水解率最高。因此，選擇料液比為1∶9.0 g/mL作為較佳的料液比。

2.1.2 酶添加量對血液水解率的影響（見圖2）

蛋白酶促進蛋白的降解本質是酶結合部位與蛋白質的特定氨基酸殘基結合后，酶催化部位降低蛋白水解發生的活化能，會有酶的飽和與底物飽和的狀態。當底物的量過大，酶結合部位達到飽和，底物濃度增大不會增加水解的發生。當底物濃度過飽和時，酶量的增加不會增加水解的發生，隨酶量的增加水解率效果與成本不成正比[10]。在料液比1∶9.0 g/mL、pH值7、溫度50 ℃、時間4 h的條件下，研究血液水解率隨酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）的變化規律。由圖2 可知，酶添加量在4 000~10 000 U/g 蛋白范圍內，血液水解率隨酶添加量的增加而提高。酶添加量在10 000~12 000 U/g蛋白范圍內，血液水解率隨酶添加量的增加而降低。在酶添加量10 000 U/g蛋白時，血液水解率最高。因此，選用酶添加量為10 000 U/g蛋白作為較佳的酶添加量。

圖2 酶添加量對血液水解率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on blood hydrolysis rate

2.1.3 pH值對血液水解率的影響（見圖3）

蛋白酶只有在一定pH值范圍下才能達到較高的水解率，pH值偏低或偏高都會對水解效果產生較大的影響。過酸或過堿都會使蛋白酶逐漸變性失活，影響酶解效果[11]。在料液比 1∶9 g/mL、溫度 50 ℃、時間 4 h、酶添加量1 000 U/g 蛋白的條件下，研究血液水解率隨pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的變化規律。由圖3可知，pH值在6.0~6.5范圍內，血液水解率隨pH 值的增大而提高。pH 值在6.5~8.0 范圍內，血液水解率隨pH 值的增大而降低。在pH值為6.5時，血液水解率最高。因此，選用pH值為6.5時作為較佳的pH值。

圖3 pH值對血液水解率的影響Fig.3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

2.1.4 時間對血液水解率的影響（見圖4）

在水解前期蛋白酶的活力比較高，與底物結合水解率較大。隨著水解時間的延長，蛋白酶的活力下降，水解率也難以提高。在料液比1∶9 g/mL，溫度50 ℃，pH值6.5，酶添加量1 000 U/g蛋白的條件下，研究血液水解率隨水解時間（2、3、4、5、6 h)的變化規律。由圖4可知，時間在2~6 h范圍內，血液水解率隨時間的增加而提高。在2~5 h 范圍內水解率上升趨勢較明顯。在5~6 h 內，水解率上升趨勢較小，此時間范圍內水解率變化較小?？紤]節省時間成本和其他消耗成本，選用水解時間為5 h 作為較佳的水解時間。

圖4 時間對血液水解率的影響Fig.4 Effect of time on blood hydrolysis rate

2.1.5 溫度對血液水解率的影響（見圖5）

在蛋白酶的適宜溫度范圍內有助于酶解反應的進行，這是因為酶的作用速度隨溫度升高而加速，但溫度升高到一定限度后，酶的活性就要鈍化，直至完全失活。在料液比1∶9.0 g/mL、時間5 h、pH值6.5、酶添加量1 000 U/g蛋白的條件下，研究血液水解率隨水解溫度（40、45、50、55、60 ℃）的變化規律。由圖5可知，溫度在40~50 ℃范圍內，血液水解率隨水解溫度的增大而提高。溫度在50~60 ℃范圍內，血液水解率隨水解溫度的升高而降低。在水解溫度為50 ℃時，水解率最高。因此，選用水解溫度為50 ℃時作為較佳的水解溫度。

圖5 溫度對血液水解率的影響Fig.5 Effect of temperature on blood hydrolysis rate

2.2 正交試驗結果

本研究以pH 值、酶添加量、料液比、溫度、時間為因素，以水解率為指標，采用5因素3水平正交試驗優化。正交試驗設計及結果見表2。由表2可知，極差分析的結果表明，各因素影響順序依次為A>C>E>D>B，即pH 值對血紅蛋白酶水解產生主要作用，其次是料液比、時間、酶添加量和溫度。較佳提取參數為A?B?C?D?E?，即得到水解較佳條件為料液比1∶10.5 g/mL、pH 值6、水解溫度50 ℃、酶濃度12 000 U/g 蛋白、水解時間7 h，此時水解率為40.42%。由于酶種類不同，此試驗各項結果均高于其他文獻，同時水解率也略高。

表2 L18（35）正交試驗設計及結果Tab.2 L18（35）orthogonal experimental design and results

3 結論

本試驗結果表明，各因素對血液水解影響的重要性順序為：pH值>料液比>時間>酶添加量>溫度。綜合考慮，風味蛋白酶水解豬血紅蛋白制備氨基酸液體肥的最佳工藝條件為：料液比 1∶10.5、pH 值6、水解溫度50 ℃、酶濃度12 000 U/g蛋白、水解時間7 h。