HPLC 法測定水楊酸鈉注射液中水楊酸鈉的含量

陳向丹，王 峻，龔 波，董書香

（湖北省獸藥監察所，湖北武漢430070）

水楊酸鈉（sodium salicylate）又名鄰羥基苯甲酸鈉，為白色或微顯淡紅色的細微鱗片，或白色粉末及球狀顆粒，用于風濕癥等。水楊酸鈉注射液由水楊酸鈉加適宜的抗氧劑和金屬絡合物制成的滅菌水溶液。靜脈注射用于馬、牛、羊、豬、犬的風濕癥，是1種解熱鎮痛藥。目前，查閱到水楊酸鈉相關分析研究內容均不涉及高效液相色譜法[1-6]，僅查閱到水楊酸鈉注射液的國內標準。其含量測定采用雙相滴定法。該法操作煩瑣，且乙醚存在刺激性大、沸點低、易燃等不安全性。為了避免使用乙醚對人體產生的刺激麻醉作用及其危險性，同時提高專屬性，本試驗擬采用高效液相色譜法對水楊酸鈉含量進行測定，為水楊酸鈉含量的測定提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀-紫外檢測器（Agilent1260 Infinity Ⅱ，OpenLAB CDS ChemiStation Edition（C.01.09[144]）色譜工作站軟件）、分析天平（梅特勒AE 240）、乙腈為色譜純、冰乙酸為優級純、水（超純水）。

1.2 藥品

水楊酸鈉對照品（含量：99.0%，批號：Z05A6Y2161，北京盛世康普化工技術研究院）；空白制劑：四川某已獲獸藥GMP認證企業提供；供試品：水楊酸鈉注射液（四川3個已獲獸藥GMP認證企業生產，含量規格均為10%，批號分別為：170401、20170101、20170901）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

最終色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱，以水-乙腈-冰乙酸（197∶100∶3）為流動相、流速1.0 mL/min、檢測波長230 nm、柱溫30 ℃、進樣量10μL。

1.3.2 溶液的制備

對照品溶液：精密稱取水楊酸鈉對照品25 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液：精密量取水楊酸鈉注射液5 mL，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述供試品溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2 結果與分析

2.1 線性與范圍（見圖1）

精密稱取水楊酸鈉對照品100 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液（約1 g/L）。分別精密量取貯備液適量，用流動相分別稀釋至濃度為25、50、100、250、500 mg/L 的溶液，各取10 μL 進樣，記錄色譜峰面積，以濃度（mg/L）為橫坐標，峰面積（mAU·s）為縱坐標，繪制標準曲線。由圖1 可知，回歸方程：y=22.481x+134.9，R=0.999 7。可見，在此色譜條件下水楊酸鈉在25~500 mg/L范圍內線性良好。

圖1 水楊酸鈉標準曲線圖Fig.1 Standard curve of sodium salicylate

2.2 準確度（見表1）

精密量取水楊酸鈉注射液制劑空白5 mL，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述供試品空白溶液5 mL，置100 mL 量瓶中。水楊酸鈉對照品按照各主成分80%、100%、120%3 個水平各3 份分別進行添加制備供試樣，按外標法以峰面積計算。由表1可知，水楊酸鈉平均回收率為99.76%，RSD為0.3%，表明該法符合試驗分析要求、準確度高。

表1 回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.3 精密度

精密吸取對照品溶液（水楊酸鈉250 mg/L）10μL，連續重復進樣6 次，測得水楊酸鈉峰面積平均值為5 953.1，RSD為0.1%，結果表明儀器精密度良好。

2.4 專屬性（見圖2）

在色譜條件下，分別取樣品空白制劑溶液、水楊酸鈉對照品溶液以及供試品溶液注入液相色譜儀。

由圖2 可知，色譜圖中水楊酸鈉峰與各雜質峰分離效果好，含量測定不受其他雜質峰的干擾。

2.5 溶液的穩定性

取同一樣品溶液（批號20170901）（含水楊酸鈉250 mg/L），按色譜條件，在不同時間（0、2、4、6、8、10、12、24 h）分別進樣10μL，記錄色譜峰面積，考察樣品的穩定性，測得水楊酸鈉峰面積平均值為5 952.9，RSD 為0.1%，結果表明，樣品溶液在室溫下24 h內性質穩定。

2.6 耐用性

在本研究的色譜條件下，分別考察了Waters SymmetryShieldRP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）以及Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）3 種色譜柱。結果表明，3 種色譜柱均可使水楊酸鈉分離度及理論塔板數良好，在本研究流動相下選擇溫度為25 ℃和35 ℃時，除出峰時間發生變化外，其余變化很小；將流動相流速調整為0.9 mL/min 和1.1 mL/min 進行測試。結果表明，流動相流速的微調也僅能影響出峰時間，對峰形和理論塔板數影響甚小。綜上所述，不同品牌的色譜柱、不同流動相流速以及不同溫度，均能滿足試驗需要，方法耐用性較好。

2.7 樣品測定（見表2）

分別取不同廠家不同批號的樣品，采用色譜條件進行測定，按外標法以峰面積計算水楊酸鈉的含量，同時按原含量測定方法測定含量。由表2可知，原方法與修訂后的方法結果基本一致，高效液相色譜法可作為水楊酸鈉注射液中主藥的含量測定的參考方法。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 The high performance liquid chromatogram

表2 樣品含量測定結果Tab.2 Results of contents determination of samples(labelled amount/%,n=3)

3 討論

3.1 提取方法的考察

水楊酸鈉在水中易溶，在乙醇中溶解。分別采用水和流動相溶解稀釋，均可較好溶解，但水溶解后相同條件采集的色譜圖中溶劑產生的色譜峰較大，故選擇流動相溶解。

3.2 流動相的選擇

查閱相關文獻，先后考察多種流動相[7-12]。反相色譜系統的流動相常用甲醇-水系統和乙腈-水系統，用紫外末端波長檢測時宜選用已經乙腈-水系統，減少鹽溶液對色譜系統的污染，提高色譜系統的穩定性，最終選用氟苯尼考及其制劑的含量測定方法的流動相。選擇此色譜條件實現1種方法兩種應用，能夠節約成本、提高效率，從某種程度上還能控制非法添加物。

3.3 檢測波長的選擇

水楊酸鈉的光譜圖最大吸收波長為230 nm 和296 nm。在本試驗色譜條件下，在296 nm處水楊酸鈉、氟苯尼考及甲砜霉素的混合對照品中的氟苯尼考及甲砜霉素基本不出峰，而在此色譜條件下230 nm處水楊酸鈉、氟苯尼考及甲砜霉素3個成分均能分離良好，根據吸收大，干擾小的原則最終選擇230 nm。

4 結論

高效液相色譜法具有經濟、快捷、所用試劑毒性小、環境友好等優點。該法操作簡單、專屬性強、準確度及重現性均較好，可作為水楊酸鈉注射液的含量測定的1種補充方法，可為水楊酸鈉注射液含量的測定提供參考。