大腸桿菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗菌株培養條件的優化

許崇利，許崇波，佘玉罕

（1. 吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林吉林132022；2. 重慶醫藥高等專科學校醫學技術學院，重慶401331；3. 韶關學院英東生物與農業學院，廣東韶關512005）

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）引起的急性傳染病。大腸桿菌利用菌毛上的抗原（又稱為黏附素）與仔豬小腸上皮細胞上的受體結合，吸取腸道內的營養物質大量繁殖，并產生腸毒素而導致強烈的腹瀉。大腸桿菌（ETEC）的主要致病因子是黏附素和腸毒素[1-4]。目前，已從豬源大腸桿菌中發現K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F18、F41、F42、F107 等多種菌毛[5-8]。腸毒素包含耐熱腸毒素（ST）和不耐熱腸毒素（LT）。ST1能夠使小腸絨毛上皮細胞內環磷酸鳥苷（cGMP）升高10倍，而且該毒素有組織特異性[9-11]。LT 由A 亞單位和B 亞單位組成，全LT 或B 亞單位均具有良好的免疫原性。LTA亞單位是大腸桿菌（ETEC）毒素的活性部位，LTB亞單位負責與GMl神經節苷脂糖蛋白受體結合，產生功能性細孔。LTA亞單位則由孔進入，激活胞漿內的腺苷酸環化酶（AC），環磷酸腺苷（cAMP）含量增加，引起腸道內環境改變，從而導致腹瀉[12-13]。

ECET腹瀉的藥物治療已經使菌株產生耐藥性。目前常使用疫苗免疫接種的方式來預防、控制新生仔豬的大腸桿菌性腹瀉。目前，應用的疫苗主要有K88-K99-987P、K88-LTB和K88-K99等基因工程亞單位疫苗[14-15]。本課題組構建重組菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)[16-17]。該重組菌株在保留K88ac 和LTB原有抗原性的基礎上，使原本不具有抗原性的ST1被賦予抗原性，并喪失ST1腸毒素的活性；并采用控制不同單因素變量的方法，探索K88ac-ST1-LTB三價基因工程疫苗菌株最適的培養方法，確定最佳培養條件，并進行滅活試驗，從而為ETEC疫苗的成功研制和生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

基因工程菌株BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)由許崇波等[15]構建。

1.2 試驗試劑

肉湯培養基：20.0 g 蛋白胨、5.0 g 牛肉粉、5.0 g 氯化鈉，加蒸餾水定容到1 000 mL，調pH值至7.5。

LB 培養基：5.0 g 酵母粉、10.0 g 氯化鈉、10.0 g 胰蛋白胨，加蒸餾水定容到1 000 mL。

改良LB培養基：5.0 g酵母粉、8.0 g胰蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g NaCl，加蒸餾水定容到1 000 mL。制備好的3 種培養基需要分別添加一定量的消泡劑。2 mol/L 氫氧化鈉調pH值至7.4~7.6，高壓滅菌20 min。

IPTG、聚丙烯酰胺等購自南京海克爾生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉購自上海新睿生物科技有限公司；牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉購自赫澎（上海）生物科技有限公司。

1.3 菌株最佳培養條件試驗

1.3.1 最佳培養基的篩選

將制備的LB、改良LB 和普通肉湯培養基分別添加至發酵罐，每罐10 萬mL，2%比例接種大腸桿菌菌株的種子液，37 ℃通氣培養6 h 后，加入葡萄糖溶液至終濃度0.2%，繼續培養16 h 進行活菌計數。每種培養基重復進行3 次試驗，記錄每種培養基的菌數，并計算平均值（CFU/mL）。

1.3.2 最佳誘導劑的篩選

4個發酵罐分別加入改良LB培養基，每罐為10萬mL，按照2%比例接種菌株的種子液，37 ℃通氣培養4~6 h后，加入終濃度為0.2%葡萄糖補充碳源，繼續培養4 h 后，每罐分別加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG、1.0 mmol/L的乳糖、10.0 mmol/L的乳糖、100.0 mmol/L的乳糖進行誘導，誘導4 h，每罐取1 mL菌液進行SDS-PAGE分析并檢測目的蛋白表達量。

1.3.3 乳糖最佳誘導條件的篩選

按照2%比例接種種子液于發酵罐中，37 ℃培養4~6 h，加入終濃度為0.2%葡萄糖補充碳源，繼續通氣培養4 h，加入終濃度為100 mmol/L乳糖誘導6 h，期間每隔1 h取1 mL菌液進行活菌計數，同時SDS-PAGE 檢測目的蛋白表達量。

1.3.4 最佳通氣量培養條件的篩選

按照2% 比例分別接種大腸桿菌BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株的種子液至3 個發酵罐，每罐10 萬 mL，3 個罐的通氣量分別為 50、100、500 L/min。37 ℃培養6 h 后，加入終濃度0.2%的葡萄糖補充碳源，繼續培養4 h，加入終濃度為100 mmol/L 的乳糖誘導6 h，取1 mL 菌液進行活菌計數，同時SDS-PAGE 檢測目的蛋白表達量。試驗重復3次。

1.4 滅活試驗

取3 罐菌數在1.15×1010~1.23×1010CFU/mL 的大腸桿菌菌液，每罐分成9份，共27份。將27份菌液隨機分成3 組，每組 9 份。將 9 份菌液分為 3 組，每組 3 份，每組分別加入終濃度為0.4%、0.6%和0.8%的甲醛溶液37 ℃滅活。滅活時間分別為12、24、48 h。滅活的過程中，需要振搖菌液數次，以保證菌液的徹底滅活。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌株生長的影響（見表1）

表1 不同培養基對菌株生長的影響Tab.1 The influence of different media on the growth of strains

由表1可知，配置的3種培養基對細菌生長影響較大，其中改良LB 培養基、普通肉湯培養基的細菌數目極顯著高于LB培養基（P<0.01）。從菌株培養環境的穩定性和降低工業化生產成本角度來說，改良LB 培養基是最適宜培養基。

2.2 不同誘導劑對菌株生長的影響（見圖1、表2）

圖1 IPTG與乳糖誘導的試驗結果Fig.1 The induced test results of IPTG and lactose

表2 不同誘導劑對菌株生長的影響Tab.2 The effect of different inducers on the growth of strains

由圖1、表2 可知，分別使用IPTG 和乳糖進行誘導表達，100 mmol/L 乳糖和1 mmol/L IPTG 誘導效果最較好，GDS-8000 凝膠成像分析系統軟件分析表明，二者表達量分別為29.43%和33.24%，考慮生產成本，宜選用乳糖作為誘導劑。

2.3 乳糖不同誘導時間對菌株生長的影響（見表3、圖2）

由表3、圖2 可知，隨著誘導時間的增加，pH 值先降低后升高，總菌數和蛋白表達量也在相應增多。當誘導時間為6 h時，蛋白表達達到最大值。GDS-8000凝膠成像分析系統軟件分析表明，蛋白表達量為30.02%。

表3 乳糖不同誘導時間對菌株生長的影響Tab.3 The effect of different induction time of lactose on the growth of strains

圖2 不同誘導時間對目的蛋白表達的影響Fig.2 Effects of different induced time on the expression of the target protein

2.4 通氣量對菌株生長的影響（見表4）

由表 4 可知，采用改良LB 培養基（10 萬mL）對BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)菌株通氣培養。其中以500 L/min的通氣培養條件培養的菌數最高，3 種通氣量對目的蛋白的表達量無明顯差異。

表4 通氣量對菌株生長的影響Tab.4 The effect of ventilation on the growth of strains

2.5 菌株滅活試驗結果（見表5）

表5 菌株滅活試驗結果Tab.5 Strain inactivation test results

選取3 種不同濃度（0.4%、0.6%、0.8%）的甲醛溶液加入培養好的菌液中滅活。由表5 可知，滅活培養菌數在1.15×1010~1.24×1010CFU/mL 之間的菌液以0.4%甲醛溶液（按菌液終濃度計算）滅活48 h，可以達到很好的滅活效果。

3 討論

本研究中，關于工業化生產中誘導劑的篩選試驗是在培養基配制好的20 萬mL 的發酵罐中進行的。該菌株37 ℃培養4~6 h 后，發酵罐內加入葡萄糖溶液（終濃度0.2%）用以補充碳源，繼續培養菌株4 h。選取等量的菌液分別添加4 種不同濃度的誘導劑（1.0 mmol/LIPTG、1.0 mmol/L 乳糖、10.0 mmol/L 乳糖和 100.0 mmol/L 乳糖）對菌株展開誘導，使目的蛋白大量表達。在誘導4 h 后每種濃度各提取1 mL菌液，在低溫（4 ℃）條件下，5 000 r/min離心 5 min，使用 100 μL 10 mmol/L Tris·Cl（pH 值 8.0）重懸菌體沉淀。依據所收集的試驗材料使用常規的操作方法進行SDS-PAGE試驗分析，得到的目的蛋白表達含量依次為33.21%、8.27%、26.39%、29.44%。根據研究資料，生產與檢驗所培養的菌種使用的培養容器等條件不同，于37 ℃溫度下進行搖床，振蕩培養2 h后，使用IPTG（終濃度為1.0 mmol/L）誘導4 h 后，可收獲所需的菌液，吸取1 mL菌液，4 ℃、5 000 r/min 離心5 min，使用100 μL 10 mmol/L Tris·C（lpH 值8.0）重懸菌體使其沉淀，并按照常規的方法步驟進行SDS-PAGE試驗分析。試驗結果表明，所獲得的目的蛋白表達量在40%左右。

上述2次試驗中，同是IPTG作為誘導劑的情況下蛋白的表達量卻相差較大。原因可能是2次誘導蛋白的容器不同，培養的體系差別較大，補料條件不同，通氣條件有差別，加入誘導劑時的菌液濃度有差別，因此導致2種情況下蛋白的表達量差別較大。

根據試驗數據分析，改良LB 中的培養菌數比LB 的高，比普通肉湯的低一點。改良LB批次之間差異小，能夠保持疫苗的免疫原性和質量穩定的優點，且其生產成本比普通肉湯低50%以上。在工業化生產中選用改良LB培養基具有更大的經濟效益。對于誘導劑來說，乳糖的加入濃度為100 mmol/L 且誘導時間在6 h 以上，目的蛋白的表達量較多。重組菌株中蛋白的表達，運用的是乳糖操縱子的原理（乳糖操縱子會轉錄表達β-半乳糖苷酶）。使用乳糖作為誘導劑，誘導的效果好且價格比IPTG低，更加適合于工業化的大量生產。在大腸桿菌培養時通入無菌空氣維持罐內的氧溶解度，可促進其大量繁殖。本試驗用10萬mL發酵罐展開培養，在相同的培養條件下對3種不同通氣量進行比較。在不影響蛋白相對表達量的情況下，培養菌數最高是500 L/min的通氣量。由于本次試驗所用菌株其質粒之中所含有的生物公害——卡那霉素抗性基因，所以在使用時必須滅活。試驗數據分析表明，終濃度0.4%的甲醛溶液在37 ℃下，攪動、滅活48 h效果最佳。

4 結論

本研究在成功地構建BL21(DE3)(pXK88acST1LTB)重組表達菌株基礎上，從培養基的選取、通氣量的多少、誘導劑的選擇以及其對應的誘導條件（誘導時間及濃度）4個方面對其培養條件進行研究。結果表明，改良的LB 培養基為培養該菌株的最適宜培養基，100 mmol/L乳糖誘導6 h，可實現經濟效益最大化，同時確定在20萬mL發酵罐中培養重組菌株的最適宜通氣量為500 L/min。滅活試驗結果表明，37℃0.4%甲醛滅活48 h，滅活效果徹底。

本研究探索K88ac-ST1-LTB三價基因工程疫苗菌株最適的培養方法，確定最佳培養條件并進行滅活試驗，從而為ETEC疫苗的成功研制和生產奠定基礎。