遠隔缺血預處理防治急性腎損傷的機制研究

崔 茜，裴漢軍

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心內科，內蒙古包頭 014010)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一組以急性腎功能損害為臨床表現的綜合癥，具有高發病率、高死亡率的特點。通常以血肌酐升高25.0 %或50.0 %，或血肌酐絕對水平上升0.5 mg/dL為標準，表現為氮質血癥、水電解質和酸堿平衡紊亂以及全身各系統并發癥，可伴有少尿(<400 mL/24 h或17 mL/h)或無尿(<100 mL/24 h)。AKI發病機制復雜，涉及多種病理過程，包括炎癥反應、內皮細胞損傷、小管上皮細胞損傷等。研究發現，大多數病理過程均與線粒體功能障礙有關[1-3]，因此線粒體功能保護、選擇性清除受損的線粒體可能成為新的治療方向[4-5]。

自噬是一種降解和回收利用細胞中大分子和受損細胞器的過程，它能夠有效的清除受損的細胞器，是細胞在多種病理情況下維持細胞活力的自我保護機制之一。遠隔缺血預處理(remote ischemic preconditioning，RIPC)是一種應用最為廣泛的新型內源性保護措施，可發揮多種器官保護作用[6-8]。RIPC可誘導預處理組織發生適應性改變，包括能量代謝改變、電解質和酸堿平衡改善、氧自由基生成減少、炎癥反應和細胞凋亡減少、微循環灌注改善等[9-10]。所有這些變化都有助于增加預處理組織對持續缺血和再灌注后的耐受性，但能否對AKI后的自噬發揮調節作用仍不明確，本研究通過體內實驗研究RIPC對AKI的保護作用及對自噬的調節作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 采用10周齡雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，質量合格證號[SCXK(京)2019-0010]。動物飼養于明暗交替(12 h:12 h)的清潔級動物飼養室中，環境溫度24～26 ℃，相對濕度50.0 %，自由進食飲水，術前12 h禁食水。動物實驗遵循包頭醫學院動物倫理委員會規定。取45只小鼠，隨機分為3組，腹腔注射10.0 %水合氯醛(10 mg/kg)，待夾尾反射消失后，進行如下操作。(1)假手術組(Sham)：后背部脊柱兩側腎區開口，游離雙側腎臟30 min后縫合創口，正常飼養23 h。(2)缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion,I/R):后背部脊柱兩側腎區開口，游離雙側腎蒂，上動脈夾30 min撤離，維持1 h后縫合創口，正常飼養23 h。(3)遠隔缺血預處理組(remote ischemic preconditioning,RIPC)：小鼠無創袖帶套住右后肢根部5 min，放松5 min，循環4次后撤離；2 h后背部脊柱兩側腎區開口，游離雙側腎蒂，上動脈夾30 min撤離，維持1 h后縫合創口，正常飼養23 h。

1.2動物模型制備 腎臟I/R模型制備以10.0 %水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射，待夾尾反射消失后，脊柱兩側腎區開口，游離雙側腎蒂，微型動脈夾阻斷雙側腎蒂30 min后恢復灌注1 h建立小鼠腎I/R模型。模型建立成功的判定標準為，夾閉腎蒂后腎臟變為暗紅色，松開動脈夾后顏色逐漸恢復為鮮紅，表明缺血/再灌注成功。RIPC組用小鼠無創袖帶套住小鼠右后肢根部，持續充氣，觀察到皮膚發紺為股動脈阻斷標志，5 min后釋放袖帶壓力，如此3個循環，2 h后按照I/R組操作進行，建立小鼠RIPC模型。

1.3樣本采集和處理 Sham組、I/R組以及RIPC組小鼠，再灌注24 h后再次麻醉，經心臟采血，置于真空采血管，以4 000 r/min離心，分離血清，置于-4 ℃冰箱保存，24 h內檢測。后背部開口分離腎臟，迅速置于液氮中保存，用于Western blot檢測。

1.4血清肌酐和尿素氮檢測 使用全自動生化分析儀(美國雅培C16000)，檢測每組小鼠血清中尿素氮和血肌酐的水平。

1.5Western blot法檢測Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平 取腎臟組織，提取蛋白，應用BCA法(美國Pierce BCA蛋白檢測試劑盒,貨號:23227)檢測蛋白濃度，采用Western blot檢測腎臟組織中Beclin 1蛋白表達水平及線粒體蛋白中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平。

2 結果

2.1RIPC對小鼠腎I/R的保護作用 為分析RIPC對小鼠腎臟的保護作用，對3組小鼠腎功能進行了分析(圖1)。與假手術組相比，腎I/R組小鼠的尿素氮及血清肌酐水平均升高(P<0.01)；與I/R組相比，RIPC組可降低I/R小鼠的尿素氮及血清肌酐水平(P<0.01)。

圖1 RIPC對小鼠腎I/R的保護作用

2.2RIPC對I/R小鼠腎臟保護的作用機制 為進一步分析RIPC的腎保護作用機制，應用Western blot對小鼠腎組織中LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1蛋白的表達進行檢測，以β-actin為內參(圖2A)。結果顯示：與I/R組相比，RIPC組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達量升高(P<0.05)(圖2B)；與I/R組相比，RIPC組Beclin 1蛋白的表達量升高(P<0.01)(圖2C)。以上結果說明，RIRC可上調小鼠I/R損傷中的自噬水平，從而發揮腎保護作用。

圖2 RIPC對LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1表達水平的影響

3 討論

本研究應用小鼠腎I/R模型，發現RIPC可明顯下調尿素氮和血清肌酐水平，驗證了RIPC在AKI中的腎臟保護作用，此外，發現RIPC可增加小鼠腎I/R模型中LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1的表達，表明RIPC可能通過上調腎I/R中的自噬發揮腎保護作用。

I/R是臨床常見的病理狀態，是造成AKI的重要病因之一。腎臟I/R的發生機制復雜，與腎臟微循環損傷、氧化應激、炎癥及凋亡等密切相關[11]。自噬作為細胞自我保護的一種防御性反應，在腎I/R損傷中發揮重要的保護作用。有實驗發現，通過抑制近端小管內的自噬反應可加劇腎I/R損傷[12]，此外，一些研究顯示，通過上調自噬可明顯抑制腎I/R損傷[13]，證明自噬是抑制腎I/R損傷、保護腎臟的有效途徑。

缺血預處理是預防I/R損傷的有效手段，在多項實驗中證明其具有明顯的器官保護作用[14-15]。近期研究發現，缺血預處理可明顯促進自噬的發生，并且對腎臟保護產生積極的作用[16]，而自噬在腎I/R中主要通過維持腎小管細胞的穩定狀態來發揮保護作用[17]。在本研究中采用了RIPC干預手段，RIPC是對遠隔組織進行缺血預處理后，從而對靶器官發揮保護作用。由于腎臟的結構及功能的特異性，使得RIPC較缺血預處理更為有效。結果顯示，RIPC與缺血預處理結果相似，同樣可減輕腎I/R損傷，且RIPC的腎保護作用機制與自噬密切相關。與缺血預處理相比，RIPC更具臨床可操作性，可減少或避免直接處理靶器官造成的損傷，因此RIPC可作為臨床治療AKI的新的較為安全有效的手段。