新型冠狀病毒肺炎患者血漿纖維蛋白原樣蛋白1的表達特點及其臨床意義

王秀雯，曹文靜，張 超，宋錦文，楊 濤，王嗣予，周春保，徐 哲，孟繁平，施 明，范 興，王福生

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第五醫學中心 感染病醫學部，國家傳染病臨床研究中心，北京 100039

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19，以下簡稱新冠肺炎)，是由新型冠狀病毒(2019-nCoV，以下簡稱新冠病毒)感染導致的疾病。截至2020年10月15日，新冠病毒已經累計造成全球3800萬余人感染，逾100萬人死亡[1-2]。新冠肺炎患者早期以發熱、干咳為主要臨床表現，部分患者伴有乏力、呼吸不暢、腹瀉、流涕、咳痰等癥狀[3]。新冠病毒感染可導致患者出現無癥狀、輕癥、中癥、重癥等不同臨床類型，甚至死亡的結局。抗病毒免疫反應對于清除新冠病毒至關重要，但過于強烈且持續的免疫反應會造成炎性因子的大量產生，進而可能引起炎性因子風暴，而炎性因子風暴被認為是新冠肺炎患者疾病惡化的重要原因[4-6]。血漿白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)水平與急性呼吸窘迫綜合征等不良事件密切相關[7]。血漿纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，FGL1)是一種由肝細胞分泌的細胞因子，作為肝細胞的絲裂原，通過促進肝細胞增殖，減弱藥物性肝損傷[8-11]。有研究表明FGL1通過調控糖脂代謝影響肝細胞脂質堆積和胰島素抵抗[4-6]。在新冠肺炎患者中也存在肝損傷和糖脂代謝異常的情況[12-14]。此外，還有研究報道IL-6以類似于急性期反應物的模式誘導FGL1的表達，提示FGL1可能作為IL-6信號通路下游效應分子，參與新冠肺炎的疾病進程[15-16]。本研究通過分析新冠肺炎患者血漿中FGL1的表達水平及其與實驗室指標的相關關系，旨在明確其對新冠肺炎患者病情評估的價值。

對象與方法

1研究對象 納入2020年1-3月解放軍總醫院第五醫學中心收治的新冠肺炎患者37例。依據國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》對新冠肺炎患者進行分型[17]。納入標準：利用RT-PCR技術在呼吸道標本檢測到新型冠狀病毒核酸。為分析輕型患者(Mild)和普通型/重型患者的差異，將普通型和重型患者歸為一組，標記為中/重型(Moderate/Severe)組。截至本研究進行數據分析，2例患者因發生多器官衰竭而死亡，其余患者均已康復出院。另選取健康對照14例，其中男性9例，女性5例，中位年齡30.00(28.00～37.25)歲。本研究經解放軍總醫院第五醫學中心倫理委員會批準(審批號：第S2020-044-02號)，所有研究對象及家屬均已簽署知情同意書。

2ELISA法檢測血漿FGL1等細胞因子水平 抽取健康對照者和新冠肺炎患者入院當天和出院前1 d空腹外周靜脈血5mL，置于真空抗凝管，離心后取上層血漿，凍存于?80°冰箱中。新冠肺炎患者和健康對照血漿均于56℃水浴中滅活30min，利用酶聯免疫吸附法檢測血漿中γ干擾素(interferonγ，IFN-γ)、IL-6和FGL1含量。FGL1檢測試劑盒購自武漢云克隆公司，IFN-γ和IL-6檢測試劑盒購自美國R&D公司。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

3統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料以Md(IQR)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析法評價血漿FGL1對新冠肺炎的病情評估價值。采用Pearson法進行相關性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1患者的臨床特征 納入新冠肺炎患者37例，根據入院時疾病嚴重程度分組：輕型組14例，男性7例，女性7例，中位年齡33.50 (22.00～41.50)歲；普通型組13例，男性8例，女性5例，中位年齡54.00(37.00～69.00)歲；重/危重型組10例，男性7例，女性3例，中位年齡62.00(37.75～78.25)歲。輕型組與中/重型組性別、白細胞計數、中性粒細胞計數、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酐、IL-6、降鈣素原、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、三酰甘油、膽固醇、血糖等無統計學差異；兩組年齡、取樣時間、合并癥、淋巴細胞計數、血清鐵蛋白、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)有統計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 新冠肺炎患者的臨床特征Tab. 1 Clinical characteristics of the COVID-19 patients

2FGL1在新冠肺炎患者血漿中的表達 檢測14例健康人、37例入院新冠肺炎患者和23例出院患者(包含在37例患者中)血漿FGL1水平。結果表明，新冠肺炎患者入院時血漿FGL1水平較健康對照明顯增高[(222.05±83.78)ng/mLvs(74.87±29.28)ng/mL，P＜0.001]，出院時血漿FGL1水平有所降低[(125.39±66.27)ng/mLvs(222.05±83.78)ng/mL，P＜0.001]，但仍未恢復到正常水平(P＜0.01)(圖1A)。入院時中/重型患者血漿FGL1表達水平較輕型患者高[(271.33±85.27)ng/mLvs(189.22±51.19)ng/mL，P＜0.01](圖1B)。

圖1 新冠肺炎患者與健康對照者血漿FGL1水平比較A：入院、出院時新冠肺炎患者血漿FGL1水平；B：入院時輕、中/重型新冠肺炎患者血漿FGL1水平Fig.1 Plasma levels of FGL1 in the COVID-19 patients and healthy controlsA: Plasma levels of FGL1 in admitted and discharged COVID-19 patients; B: Plasma levels of FGL1 in the mild and the moderate/severe COVID-19 patients

3血漿FGL1對新冠肺炎患者病情的評估價值分析 進一步探討其血漿FGL1等指標對新冠肺炎患者病情的評估價值。以中/重癥新冠肺炎組為陽性樣本，以輕型新冠肺炎組為陰性樣本，建立ROC曲線診斷分析模型。經ROC分析知，FGL1在評估中/重型新冠肺炎的Cut-off值為203.84ng/mL，曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.780 (95%CI: 0.631～0.928)，敏感度78.57%，特異性73.91%(圖2)。在評估中重型新冠肺炎時，FGL1較CRP、IL-6曲線下面積更大(圖2和表2)。

表2 FGL1、CRP及IL-6評估中/重癥新冠肺炎病情的價值Tab. 2 Diagnostic value of FGL1, CRP and IL-6 in moderate/severe COVID-19

圖2 血漿FGL1、CRP、IL-6評估中重型新冠肺炎的ROC曲線Fig.2 ROC curves of plasma FGL1, CRP and IL-6 in predicting moderate/severe COVID-19

4新冠肺炎患者血漿中FGL1與IL-6、IFN-γ相關性分析 對新冠肺炎患者血漿中FGL1與IL-6、IFN-γ三個指標做Pearson相關分析，結果顯示新冠肺炎患者血漿FGL1水平與IL-6水平呈顯著正相關(r=0.588，P＜0.001)，與IFN-γ也呈顯著正相關(r=0.378，P=0.017)(圖3)。

圖3 新冠肺炎患者血漿FGL1與IL-6、IFN-γ相關性分析Fig.3 Correlation analysis of plasma FGL1 with IL-6, IFN-γ in the COVID-19 patients

討 論

自新冠肺炎疫情暴發以來，全球已有累計3800萬人被感染，100萬人死亡[1]。大多數新冠肺炎患者僅有較輕的癥狀且可自愈，但部分患者，尤其是老年和患有基礎疾病的患者，有更高的風險進展為重癥甚至死亡[18]。新冠病毒感染導致患者體內細胞因子和趨化因子水平大幅增加。重癥監護室內的新冠肺炎患者外周血中IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IP-10、MCP1等細胞因子表達顯著增高[19]。IL-6具有強烈的致炎性，是新冠肺炎患者體內引起炎性因子風暴的關鍵因素之一。目前靶向IL-6的抗體已經進入臨床試驗階段，部分重癥新冠肺炎患者能夠從中受益[20]。IL-6和IL-10等可作為新冠肺炎患者發展為重癥的預測指標[7]。FGL1是肝細胞分泌的生長因子，在肝損傷的病理情況下，被IL-6誘導表達，促進肝再生和組織修復[10,16]。新冠肺炎患者體內的FGL1可能作為IL-6的下游調控分子調控新冠肺炎的疾病進程。

本研究通過ELISA技術檢測了37例新冠肺炎患者和14例健康對照者血漿中FGL1含量，發現FGL1在新冠肺炎患者外周血中表達顯著增高，且中/重型患者血漿FGL1水平較輕型患者進一步升高；血漿FGL1與IL-6、IFN-γ水平呈正相關。通過ROC曲線分析，本研究發現血漿FGL1對于新冠肺炎疾病嚴重程度的診斷具有較高價值。FGL1作為生長因子，調控肝再生和組織修復。部分新冠肺炎患者存在肝損傷的情況，且與疾病嚴重程度密切相關[12,21]；FGL1可能通過參與肝損傷進而影響新冠肺炎的疾病進程[10]。FGL1除調控肝再生之外，還能調控糖代謝和脂質代謝。新冠肺炎患者存在著糖脂代謝的異常，血糖對于新冠病毒復制、炎性因子產生以及新冠肺炎患者轉歸有重要影響[13-14,22]。最近的研究表明，FGL1是免疫檢查點分子LAG-3的配體，可通過LAG-3抑制T細胞功能[23]。新冠病毒感染人體后，外周血中CD4和CD8T細胞中LAG-3的表達均顯著升高，可能會受到FGL1的調控，進而影響新冠肺炎的疾病進程[24-25]。雖然新冠肺炎患者體內的FGL1可能是由IL-6誘導產生的，但在不同疾病嚴重程度患者體內FGL1的變化比IL-6更為敏感，血漿FGL1的水平能敏感地區分輕型患者與中/重型新冠肺炎患者，因此有望成為比較理想的病情評估指標。

綜上所述，本研究發現感染新冠病毒后，患者血漿FGL1表達水平上調，且與疾病嚴重程度相關。同時FGL1可以作為一個新的病情評估指標，用于區分輕型和中/重型新冠肺炎患者。由于本研究的樣本量有限，未能檢測患者肺部組織中FGL1的變化特點，也未能觀察到FGL1水平與新冠肺炎患者臨床預后的關系，仍需要在更多的樣本上驗證。FGL1可能通過調控肝細胞的再生，機體糖脂代謝水平以及LAG-3陽性免疫細胞的功能，參與新冠肺炎的疾病進程。FGL1在新冠肺炎病理過程中的作用仍需要通過功能實驗和動物模型驗證。