早中期股骨頭壞死樣本的骨微結構分析

李 獲，孟昊業，馬海洋，高健明，廖思達，趙 軍，王 鵬,，黃 波,，王 皓,，趙金娟，魯曉波，彭 江,

1 西南醫科大學附屬醫院 骨與關節外科，四川瀘州 646000；2 解放軍總醫院第一醫學中心 骨科研究所，骨科再生醫學北京市重點實驗室，全軍骨科戰創傷重點實驗室，北京 100853

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)又稱股骨頭缺血性壞死或無菌性壞死，是骨科常見的導致嚴重后果的疾病。ONFH的病理特點之一是軟骨下血管微循環，尤其是較小的支持血管受損，隨后導致骨壞死、股骨頭內微骨折的發生，最終會發生軟骨下骨塌陷。臨床癥狀主要表現為腹股溝區疼痛，部分患者髖關節活動受限，少數患者伴有膝關節疼痛[1-2]。該疾病的全球流行病學情況尚不清楚，據統計我國非創傷性股骨頭壞死患者累積已達812萬，男性患者顯著多于女性，糖皮質激素、飲酒、高血脂、肥胖、高危職業(潛水員)、吸煙、糖尿病等均為非創傷性骨壞死的風險因素[3]。當前的治療方案主要包括手術和非手術治療，非手術治療主要包括減輕負重、使用抗凝劑、血管擴張劑、中藥、雙膦酸鹽和各種非侵入性生物物理方法(如電磁刺激、體外沖擊波治療和高壓氧)等。但非手術治療不適用于已經發生軟骨下塌陷的ONFH。手術治療包括髓心減壓、截骨術、血管化或非血管化腓骨移植等。全髖關節置換術是終末期股骨頭骨壞死的治療方法[4]。大部分ONFH患者處于青壯年，一旦患病，絕大多數患者將會發生股骨頭塌陷，最終不得不行全髖關節置換術。對ONFH病理生理學的認識將有助于我們選擇更好的治療方法。現有的研究多集中于國際骨循環研究學會(ARCO)Ⅲ～Ⅳ期的骨壞死，此時的股骨頭已發生軟骨下骨折，股骨頭塌陷，同時伴有骨關節炎和關節間隙狹窄，這對于早期股骨頭壞死的防治與塌陷的預防效果有限。因此，我們的研究旨在分析早中期ONFH標本微觀結構變化及其原因，探索早中期骨壞死標本中不同區域內部結構變化規律，探討股骨頭骨壞死不同區域結構改變及成骨能力的變化，尋找可能的塌陷原因及可能的預防方法。

材料與方法

1標本來源 收集2019年3月-2020年1月，于解放軍總醫院第一醫學中心行全髖關節置換術患者切除的股骨頭10例 (男性5例，女性5例)，年齡41～66歲，平均52歲。術前起病時間3～24個月，平均9.5個月。病因與激素使用相關。所有病例ARCO分期均為Ⅱ期。

2顯微CT 將臨床收集的行髖關節置換術患者的股骨頭骨壞死標本在電鋸下沿冠狀位切開，切片厚度5mm，之后所有股骨頭標本均行顯微CT(GE Explore Locus，USA)掃描，掃描分辨率為45μm，掃描電壓為80kV電流為450μA，曝光時間為400ms。在顯微CT掃描圖像中，將股骨頭分為壞死區、硬化區和健康區。從這些區域選取感興趣區(region of interest，ROI)，大小0.5cm×0.5cm×1cm進行三維重建分析，分析骨礦密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁間隙(trabecula space，Tb.Sp)、骨小梁數(trabecula number，Tb.N)和骨小梁厚度(trabecula thickness，Tb.Th)。

3標本處理 股骨頭壞死標本行micro-CT掃描之后，用4%多聚甲醛固定，脫鈣、脫水、包埋、切片，行蘇木精伊紅(HE)及Goldner三色染色，并觀察其結構變化。每個分區隨機選取5個視野統計血管面積，取平均值作為該區域血管面積。

4統計學分析 統計軟件為SPSS20.0。所有數據均為計量資料，以表示。組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1大體觀察 在冠狀位切面(圖1A)可見關節軟骨連續，厚度正常。股骨頭內黃色壞死區與周圍分界清楚，不同標本壞死區位置及范圍分布不一。

2影像學評價 X線片顯示，股骨頭表面光滑，無新月征出現，股骨頭內部未見明顯壞死區、囊性變及硬化區，關節間隙正常(圖1B)。切片高分辨率X線片(圖1C)顯示股骨頭形狀結構完整，壞死區骨小梁數目稍有降低，其中存在骨吸收區，壞死區周圍可見明顯硬化帶形成。正常區骨小梁結構及連續性較好。micro-CT圖像中(圖1D、圖2)，軟骨下骨、壞死區、硬化區和健康區的骨小梁排列和結構特征明顯不同。軟骨下骨骨小梁連續、完整，壞死區骨小梁不完整、斷裂，可見明顯骨折線。硬化區位于壞死區與正常區交界，骨小梁厚度明顯增加。健康區骨小梁結構相對正常。骨計量參數分析表明，硬化區BMD均數以及BV/TV高于壞死區和健康區(P< 0.05)，Tb.Th在硬化區明顯降低，與健康區差異有統計學意義(P< 0.05)，而各區域Tb.N、Tb.Sp差異均無統計學意義(表1、圖3)。

圖3 骨計量學分析及血管面積 (aP < 0.05, vs healthy region)A：骨礦密度；B：骨體積分數；C：骨小梁數目；D：骨小梁間隙；E：骨小梁厚度；F：不同分區血管面積Fig.3 Comparisons of trabecular parameters and vessel areas between different groups (aP < 0.05, vs healthy region)A: bone mineral density (BMD); B: bone volume fraction (BV/TV); C: trabecula number (Tb. N); D: trabecula space (Tb. Sp);E: trabecula thickness (Tb. Th); F: vascular area

表1 不同分區骨分析參數(n=10)Tab. 1 Bone analysis parameters of different regions in ONFH ( n=10)

圖1 股骨頭壞死標本切片 A：大體；B：X線片；C：高精度X線片；D：顯微-CTFig.1 Two-dimensional images of ONFH A: section of ONFH; B: X-ray; C: X-ray high-definition; D: micro-CT

圖2 股骨頭壞死標本micro-CT三維重建圖(a：壞死區；b：硬化區；c：健康區)Fig.2 Two-dimensional micro-CT images of ONFH and reconstructed three-dimensional image (a: necrotic region; b: sclerotic region; c:healthy region)

3HE染色 在病理組織切片中發現，股骨頭外形結構完整。軟骨厚度正常，表面光滑，軟骨下骨結構基本完整，無軟骨下骨折，潮線連續。軟骨下骨小梁未出現明顯變細、部分骨小梁出現斷裂，壞死骨小梁內出現空骨陷窩，同時部分區域可見軟骨下血管侵入軟骨層(圖4)。壞死區骨小梁骨陷窩中骨細胞消失，骨髓腔細胞壞死。壞死區與健康區及硬化帶分界明顯。壞死區骨小梁變細，組織結構紊亂，失去原有結構和連續性、排列散亂，小梁周圍可見多核破骨細胞。硬化區骨小梁呈骨性增生，排列緊密、規則，與健康區骨小梁相比，硬化區原有骨小梁存在大量空骨陷窩，而表面存在大量新生骨小梁，小梁周圍可見成骨細胞，硬化區骨小梁明顯增粗，小梁間隙變窄，排列致密規則，結構完整(圖4)。修復反應區骨小梁存在大量空骨陷窩，周圍可見明顯炎癥細胞聚集，大量肉芽組織出現，血管較其他區域明顯增加(圖4)，炎癥細胞廣泛浸潤，部分可見肥大細胞。骨髓腔內大量纖維結締組織增生包裹骨小梁碎片。健康區骨小梁排列正常，結構較完整，厚度均勻，骨髓腔造血組織、脂肪細胞及骨細胞相對正常(圖4)。

圖4 股骨頭壞死標本不同區域HE染色Fig.4 HE staining images of a paraffin section of different regions

4Goldner染色 goldner三色染色顯示軟骨厚度正常，表面較光滑，壞死區骨小梁、結構紊亂，連續性消失，小梁內骨細胞死亡，小梁表面大多數為紅色的成熟骨，少量綠染的類骨質分布于小梁周圍。與健康區骨小梁相比，硬化區骨小梁表面大量綠染的新生類骨質，健康區骨小梁排列結構正常，類骨質在小梁表面均勻分布(圖5)。

圖5 股骨頭壞死標本不同區域Goldner染色Fig.5 goldner staining images of a paraffin section of the subchondral bone

討 論

股骨頭壞死病理過程包括壞死和修復，大部分病例最終會出現塌陷。目前股骨頭骨壞死的治療方法對于逆轉疾病的發生過程作用有限。糖皮質激素相關性骨壞死的病理改變主要包括骨細胞的凋亡以及骨細胞生成和死亡的失衡[5]。

本研究通過micro-CT及病理切片染色，對早中期激素性股骨頭骨壞死標本進行內部微觀結構分析，發現早中期股骨頭壞死標本軟骨下骨區結構基本完整，但部分區域出現血管侵入軟骨層，正常生理條件下，人類軟骨既不含血管，也不含神經，同時具有抵抗血管侵入的能力，有研究認為在骨-軟骨交界處的血管生成主要與軟骨下骨和非鈣化骨之間通道形成有關[6]。Pesesse等[7]認為當骨-軟骨連接處存在微骨折現象，就會形成軟骨下板至非鈣化軟骨的通道，于是關節軟骨下的液體、細胞及細胞因子持續增加，導致軟骨下骨不正常的血管新生。這與我們的研究結果一致。既往的研究多關注中晚期的股骨頭壞死標本，此時軟骨下骨已經發生塌陷，這對于評價軟骨下骨塌陷過程作用有限。我們通過觀察早中期股骨頭壞死樣本發現，盡管早中期骨壞死患者X線片和CT未見明顯軟骨下骨骨折線，但軟骨下骨已經發生微骨折，這可能是早中期股骨頭壞死軟骨下骨特征性改變之一，這種改變導致了骨與軟骨之間的屏障消失，不能繼續維持軟骨的生理微環境穩定，這可能與股骨頭壞死導致的關節炎有密切的聯系。軟骨下骨改變后將會進展為軟骨下骨折，在X線片表現為新月征的形成，并最終導致塌陷的發生。這種跨過骨-軟骨交界的新生血管長入非鈣化軟骨層時，會導致軟骨內骨化[7]。不正常的骨生長破壞了關節結構的穩定性，將會導致骨關節炎的發生。另外一項研究發現促血管新生因子不僅能促進血管新生，可能也會促進神經生長，并且血管細胞產生的分子也會刺激和誘導神經生長。感覺神經隨著新生血管長入關節，最終進入非骨化關節軟骨[6]。因此這種血管新生不僅導致結構的破壞，還有可能是早期骨壞死患者發生疼痛的原因。

壞死區骨小梁結構完整性消失，小梁表面新生骨較少，內部存在大量空骨陷窩。Plenk等[8]曾提出三種骨壞死修復方式：有限修復、破壞性修復以及重建性修復。我們認為，股骨頭骨壞死修復過程中存在兩種骨修復方式，在壞死區，出現大范圍的骨小梁結構改變，原有的骨小梁被破骨細胞所吸收，此處破骨快于成骨，我們稱之為破骨性骨修復。股骨頭壞死的骨吸收區容易出現微骨折，從而導致結構的不穩，有報道認為骨壞死的吸收區對于股骨頭壞死的塌陷過程有著非常重要作用[9-11]。Gao等[9]提出激素性股骨頭骨壞死塌陷與股骨頭內骨量減少和骨質疏松密切相關，認為強度降低的骨小梁在持續的應力作用下產生微骨折，修復過程被激活，微骨折和修復過程反復發生，最終導致股骨頭塌陷，其中塌陷的骨小梁被再吸收并被非骨組織取代。CT骨計量參數顯示，BMD、BV/TV、Tb.Th出現明顯變化，而Tb.N、Tb.Sp未見明顯變化，由此可見早中期股骨頭骨壞死區骨小梁結構基本正常，因此我們提出保持壞死區原有骨小梁結構，這對于維持其正常力學結構相當重要。

而在硬化區，骨小梁厚度明顯增加，在原有的骨小梁表面有大量的新生類骨質，新生骨小梁包繞原有骨小梁生長，此處成骨明顯強于破骨，我們稱之為成骨性骨修復。我們的研究發現硬化區骨小梁厚度明顯增加，新生類骨質較多，這表明硬化區成骨相當活躍。我們前期的研究中采用無水乙醇局部注射制備的鴯鹋的股骨頭骨壞死模型，結果發現原有骨小梁結構保持完整，在小梁間隙之間存在大量新生骨質，與原有骨小梁整合在一起共同持重，表現為成骨性骨修復[12]。因此我們推測通過干預手段將壞死區的破骨性骨修復轉變為成骨性骨修復，從而減緩甚至逆轉股骨頭骨壞死塌陷，這將是我們下一步的研究方向。

Li等[13]在修復反應區觀察到有明顯的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達，而VEGF除了參與血管生成，還能夠調節血管內皮細胞、成骨細胞、破骨細胞的募集并影響其活性。Fessel[5]發現在早期的非創傷性骨壞死標本中，VEGF和成纖維細胞生長因子-2呈中等或強染色，這表明這些因子在早期骨壞死標本中表達升高。我們通過研究骨頭骨壞死早中期標本，發現修復反應區血管較其他部位明顯增加，這與之前的研究結果一致。血管生成與骨的修復過程密切相關，在股骨頭壞死患者中，盡管破骨細胞主導的骨吸收被認為是股骨頭塌陷的結果，但具體的修復過程仍不是特別清楚。血管生成是股骨頭壞死修復反應的重要組成部分[14]。有文獻指出促血管生成因子能夠刺激骨細胞，促進骨修復[15]。而骨折部位的血管減少或異常與骨形成和骨量減少密切相關[16-17]。我們的研究發現在修復反應區不論是早期還是中期骨壞死標本都存在大量纖維肉芽組織，且血管數量較其他區域明顯增加，大量新生的血管帶來大量肉芽組織和炎癥細胞，這是股骨頭骨壞死修復的重要因素。VEGF能增加破骨細胞生成和吸收活性[18-19]。堿性成纖維細胞生長因子也能在刺激血管生成的部位刺激破骨細胞對骨的吸收[20]。早期骨壞死標本的修復反應區可見大量空骨陷窩的骨小梁結構，而我們前期的研究發現中期和晚期骨壞死標本，其修復反應區充滿大量纖維結締組織和炎癥細胞，很少或幾乎不能見到骨小梁結構，我們推測這可能與大量的新生血管使得修復反應區破骨活動增加有關。生成具有良好力學特性的新骨往往經歷成骨細胞的增殖與分化、類骨質形成、骨質礦化等一系列過程，時間需要近3個月，而破骨細胞僅需約3周就會顯著影響骨小梁的力學強度。

本研究發現在股骨頭骨壞死的初期，壞死區骨小梁本身的結構并無明顯改變，但修復過程啟動以后，新生血管長入，破骨激活要對死骨進行破骨活動，然后再在此基礎上進行成骨活動，正是因為前一階段的破骨活動，導致了骨小梁的力學強度降低，最終導致微骨折出現。這與我們之前的研究結果一致[21]。

有文獻指出，血管內皮細胞能誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞系方向分化，并且骨內的血管內皮細胞活性與參與骨改建的細胞活性關系密切。血管內皮細胞在受到相關刺激后能釋放調節成破骨相關因子，可以抑制破骨細胞活性，同時刺激成骨細胞增殖，大量的新生血管在幫助修復的同時可能也同時加速了壞死區的骨吸收反應。因此，我們設想如果對修復反應區進行干預，讓骨修復反應進行的同時，減少骨吸收反應，也許能夠改善股骨頭壞死塌陷的病理過程。

綜上所述，當股骨頭壞死發生時，整個股骨頭不同位置結構的微觀變化過程并不相同，因此對于股骨頭壞死的治療應該有針對性。對于軟骨下骨區，保護好骨-軟骨連接，維持骨與軟骨之間的屏障，使其能夠繼續維持軟骨的生理微環境穩定從而防止新生血管的長入，預防軟骨下骨折的發生，保護關節面完整性。對壞死區死骨進行保留，改變成骨方式，轉破骨性骨修復為成骨性骨修復，從而增加支撐強度，避免塌陷的發生，如Belfrage等[22]通過大鼠實驗證實雙磷酸鹽能夠減緩大鼠體內異體骨的吸收，同時可在異體骨表面直接生成新的骨小梁結構。對于修復反應區，在保證成骨能力的同時抑制破骨細胞的活性。對于股骨頭骨壞死標本的研究能夠為ONFH患者股骨頭的塌陷預防和治療提供更好的服務。我們下一步的研究將著力于收集更多早期骨壞死標本，對早期骨壞死標本進行相關病理和力學分析，因為隨著病程的進展，壞死修復過程可能存在較大差異，還有可能使得相關的力學因素隨之發生改變，這需要進一步擴大早期骨壞死樣本進行研究。同時，樣本在進行組織學處理時已經歷較長的手術過程，相關的組織結構可能已經發生一些改變，這些問題是我們下一步研究的方向。