葛根素對去勢腦缺血大鼠學習記憶功能的影響*

杜海娜 齊汝霞 石 宏 欒 天 叢群又 公 毅

(濟寧醫學院基礎醫學院，濟寧 272067)

缺血性卒中發病率高于出血性卒中，占腦卒中總數的60%～70%。已成為老年人致殘致死的最主要原因，給社會和家庭帶來沉重經濟和精神負擔。對女性來講，絕經前卒中發病率顯著低于同年齡段男性，但絕經后則顯著高于同年齡段男性，且預后更差[1]，說明雌激素對腦卒中具有保護作用[2]。Gibson等[3]證實雌激素能夠減少腦卒中梗死容積。大樣本臨床研究顯示，雌激素可減輕腦卒中發病率和死亡率，但同時也可以增加乳腺癌和子宮內膜癌等風險[4]。而植物雌激素對乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的增殖均有抑制作用[5]。葛根素是從野葛的根部分離出的一種異黃酮類化合物，屬于植物性雌激素，具有和雌激素相似的作用，其對不同類型的神經性疾病具有一定保護作用，并且能增強去勢大鼠的學習和記憶認知功能，減少海馬 CA1 區神經元的凋亡[6]。

葛根素對去勢腦缺血大鼠有何影響未見報道，本課題組擬利用去勢腦缺血大鼠模型，觀察葛根素對其學習記憶功能的影響并進一步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗儀器 低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠，LDZ5-2)；組織勻漿機(IKA，KB5/10)；722型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司，707040913)；跳臺儀(中國醫學科學院藥研所)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，357-906301)；電熱恒溫培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司，LI-9082)。

1.1.2試劑 葛根素注射液(山東方明藥業集團股份有限公司，H20033292)；TTC染色液(美國索來寶公司，T8170)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所，A003-1-2)；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所，A001-3-2)；總蛋白定量測試盒(BCA法)(南京建成生物工程研究所，A045-4-2)；乙酰膽堿(Ach)測試盒(南京建成生物工程研究所)；乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒(南京建成生物工程研究所，A024)。

1.1.3實驗動物及分組 清潔級健康SD雌性大鼠，15月齡，體重約220g，山東魯抗醫藥股份有限公司提供(許可證號：SCXK(魯)20130001)。實驗前在恒溫、恒濕實驗室飼養1周，自由進食進水。將大鼠隨機分為6組，正常對照組、OVX+2VO組、Sham-OVX+2VO組、葛根素低劑量組(25mg·kg-1)、中劑量組(50mg·kg-1)、高劑量組(100mg·kg-1)，每組8只。葛根素低劑量組(25mg·kg-1)、中劑量組(50mg·kg-1)、高劑量組(100mg·kg-1)在OVX和單側頸總動脈結扎后，分別給予葛根素注射液0.2ml·100g-1腹腔注射，每天1次。其它組給予等體積蒸餾水，方法同上。所有動物實驗符合動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1OVX+2VO大鼠模型制備 10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射將大鼠麻醉后，俯臥位固定，備皮并消毒，于雌性大鼠背外側髖關節部位縱行剪開皮膚約 1.5cm，鈍性分離皮下組織和肌層，于腹腔內找到“菜花樣”卵巢組織，結扎輸卵管，切除雙側卵巢后閉合傷口。接著行頸部手術，暴露一側頸總動脈，小心將血管和神經分離，結扎血管遠心端和近心端，從中間將血管剪斷，縫合傷口。1周后相同方法結扎另一側頸總動脈，OVX+2VO模型制備成功。Sham-OVX+2VO大鼠只結扎雙側頸總動脈不切除卵巢。

1.2.2TTC染色 將大鼠麻醉(方法同上)后斷頭取腦，在-18℃冰箱中冷凍約20min，將鼠腦置入專用腦槽，連續切成6片，厚度2mm，依次放入十二孔板中，注入2% TTC染色液，避光，放入37℃恒溫培養箱25min后，用無菌注射器將染色液抽出后，用4%多聚甲醛固定24h，正常大腦組織染成鮮紅色，缺血組織呈蒼白色，將染色完成的大腦組織按切片順序排列，用數碼相機拍照[7]。

1.2.3WST-1法測定SOD活力 將大鼠麻醉后斷頭取腦，立即放入裝有冷生理鹽水培養皿中，取出海馬，稱重后加9倍體積的生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3000rpm，離心10min，取上清即10%組織原漿備用。嚴格按照試劑盒說明書提供步驟進行操作，各孔混勻后，37℃孵育20min，450nm處酶標儀讀數，得到各孔OD值，將數據代入公式進行計算：SOD活力(U/mgprot)=SOD抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數(0.24ml/0.02ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)。

1.2.4TBA法測定 MDA含量 按以上方法制備海馬組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書提供步驟進行操作，離心管混勻后，95℃水浴40min，取出后流水冷卻，然后4000rpm離心10min。取上清，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調零，測各管OD值。利用公式計算MDA含量：MDA含量(nmol/mgprot)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10nmol/ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)。

1.2.5AchE測定 按以上方法制備海馬組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。各管混勻后靜置15min，波長412nm，0.5cm光徑，雙蒸水調零，測定各管OD值，利用公式計算組織中的AchE活力：AchE活力(U/mgprot)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(1μmol/ml)÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)。

1.2.6Ach測定 按以上方法制備海馬組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。各孔混勻后，靜置10min，550nm處，取200ul于96孔板在550nm處酶標儀測定各孔OD值，利用公式計算Ach含量：Ach含量(ug/mgprot)=(測定OD值-測定空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(400μg/ml)×樣本測試前稀釋倍數÷蛋白濃度(mgprot/ml)。

1.2.7跳臺實驗 實驗分為訓練期和實驗期。訓練期，將大鼠放到跳臺箱內熟悉3min，然后通36V交流電5min，大鼠受到電擊后，正常反應是跳上平臺逃脫電擊。如果大鼠始終沒有跳上平臺則棄去不用。訓練結束24h后，再次將大鼠放入跳臺內適應3min，通電5min，記錄大鼠第一次跳上平臺的時間(即跳臺潛伏期)，觀察大鼠在5min內跳下平臺的次數(即錯誤次數)，若5min內大鼠未跳下平臺，錯誤次數為0，跳臺潛伏期為5min[8]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠腦缺血情況

正常對照組大鼠腦組織染成鮮紅色，Sham-OVX+2VO組和OVX+2VO組腦缺血組織呈蒼白色，給予葛根素治療后，葛根素干預組腦缺血情況得到明顯改善，隨劑量增加，缺血面積逐漸減少。見圖1。

注：1-正常對照組；2-Sham-OVX+2VO組；3-OVX+2VO組；4-葛根素低劑量組；5-葛根素中劑量組；6-葛根素高劑量組。

2.2 各組大鼠SOD、MDA、AchE、Ach的活性含量水平

與正常對照組比，Sham-OVX+2VO組和OVX+2VO組SOD活力均降低、AchE活性升高、Ach含量減少(P<0.05)，OVX+2VO組MDA含量明顯升高(P<0.05)。與OVX+2VO組比，葛根素使SOD活力升高，且隨劑量增加，作用明顯增強(P<0.05)；葛根素100mg·kg-1組能減低MDA含量(P<0.05)，降低AchE活性(P<0.05)升高Ach含量(P<0.05)。見表1。

表1 各組SOD活力、MDA含量、AchE活性及Ach含量比較

2.3 各組大鼠跳臺實驗結果

與正常對照組相比，Sham-OVX+2VO組和OVX+2VO組的潛伏期明顯縮短(P<0.05)，錯誤次數增多(P<0.05)；與OVX+2VO組相比，葛根素50mg/kg組、葛根素100mg/kg組潛伏期明顯延長(P<0.05)，錯誤次數減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠跳臺實驗潛伏期和錯誤次數比較

3 討論

絕經后女性缺血性腦卒中發病率逐年上升，其所致患者死亡數約占女性死亡人數的1/6[9]。缺血后的后遺癥多見，除引起運動和感覺異常外，還伴有認知功能障礙，嚴重影響患者的生活質量[10]。如何防治絕經后女性腦卒中已成為亟待解決的社會和醫學難題。

本課題組采用OVX合并2VO制備去勢腦缺血實驗模型，能夠較好地模擬絕經后女性伴發腦缺血的狀態。TTC染色后，Sham-OVX+2VO組和OVX+2VO組腦缺血組織呈蒼白色，且OVX+2VO組腦缺血更明顯，說明OVX合并2VO加重腦缺血，可以解釋為何絕經后女性缺血性腦卒中的發病率高于男性，且更嚴重。葛根素隨劑量增加，大鼠腦缺血情況逐漸減輕，提示其對OVX合并2VO大鼠的缺血性損傷有保護作用。

腦組織發生缺血缺氧后，通過酶系或非酶系統產生氧自由基，過量的自由基攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質的過氧化反應，并形成MDA、酮基、羥基等脂質過氧化物，以及新的氧自由基。可見測定MDA含量能夠反映體內脂質過氧化程度，間接反映缺血對細胞造成的損傷[11]。SOD對機體氧自由基具有清除能力，以防止自由基對細胞造成的損傷[12]。葛根素能降低MDA含量并隨劑量增加升高SOD活力升高，提示其對缺血性腦損傷具有保護作用。

Ach是第一個被發現的腦內神經遞質，主要涉及記憶、學習、運動和覺醒的調節。膽堿能神經末梢以膽堿和乙酰輔酶A為原料，在膽堿乙?；傅淖饔孟潞铣葾ch，合成后儲存在突觸前膜的囊泡內。當神經沖動到達神經末梢時，突觸前膜與囊泡膜融合發生破裂，以胞裂外排的方式釋放Ach，釋放出的Ach在AchE的作用下水解失活。腦內的AchE主要分布在大腦額葉、頂葉和海馬，而海馬與學習記憶的關系最為密切，若海馬組織中AchE活性增強，可降低神經突觸間隙Ach水平，影響神經突觸傳遞，導致學習記憶和認知功能降低[13-14]。本實驗中，OVX+2VO組大鼠海馬組織中AChE 活性升高，Ach含量降低。葛根素干預后海馬組織中AchE活性降低，Ach含量提高。在跳臺實驗中，葛根素組大鼠跳臺潛伏期明顯延長，錯誤次數減少，說明葛根素可能通過增強AchE活性提高去卵巢合并慢性腦缺血大鼠的學習記憶功能。

綜上所述,葛根素對去勢腦缺血大鼠的學習記憶功能有改善作用，其機制可能與其抗氧化自由基作用減輕腦缺血所致損傷，同時抑制AchE活力，促進Ach的突觸傳遞功能有關。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。