Ghrelin對6-OHDA誘導SH-SY5Y細胞線粒體損傷和細胞凋亡的影響*

高文明 李嘉錚 王慧青 董 康 孟 堯 程葆華△

(1濟寧醫學院基礎醫學院；2濟寧醫學院臨床醫學院，濟寧 272000；3山東大學齊魯醫學院，濟南，250014)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的神經退行性運動障礙性疾病，以運動和非運動癥狀為主要臨床表現[1]。以中腦黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺能神經元進行性丟失，殘存的多巴胺神經元內出現路易小體為主要病理學特征[2]。PD發病的確切機制尚不十分清楚，現有的證據表明線粒體功能損傷與PD 的病理生理學有關[3]。凋亡是最常見的程序性細胞死亡形式，與線粒體功能密切相關，原因是內在的凋亡途徑與線粒體去極化有關[4]。6-OHDA是兒茶酚胺的羥基化衍生物，其結構與兒茶酚胺類似，是一種有效導致多巴胺神經元變性的神經毒劑，廣泛用于選擇性兒茶酚胺能神經毒劑作用的細胞或者動物PD模型[5]。

Ghrelin又名胃饑餓素，是生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的唯一內源性配體[6]。Ghrelin可促進生長激素釋放，參與多種內分泌調節過程，具有抗凋亡、抗氧化作用，可以拮抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡喃(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyran，MPTP)所致的神經毒性，發揮神經保護作用[7-9]。Ghrelin對于6-OHDA所致的線粒體損傷和細胞凋亡的作用還有待研究。本實驗通過6-OHDA處理人神經母細胞癌細胞(SH-SY5Y細胞)，構建PD體外模型，觀察Ghrelin對線粒體功能和細胞凋亡的影響，探究其神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 Ghrelin(美國Phoenix Pharmaceuticals公司)；SH-SY5Y細胞(美國菌種保藏中心)；6-OHDA(美國Sigma公司)；DMEM培養液(美國Hyclone公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；LDH(中國南京建成生物有限公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(中國江蘇凱基有限公司)；RIPA裂解液(中國碧云天生物技術有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國天根生物有限公司)；超敏ECL化學發光試劑盒、Bcl-2抗體(中國萬類生物科技有限公司)；Bax抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(北京中山金橋有限公司)。

1.1.2儀器 CO2培養箱(美國Thermo公司)；超聲波細胞粉碎儀(江蘇波場智能科技股份有限公司)；微量移液器(德國 Eppendorf公司)；臺式低溫高速離心機(美國Beckman公司)；酶標儀、電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；普通光學顯微鏡、倒置生物顯微鏡(日本Olympus公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(SP8)(德國 Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 SH-SY5Y細胞培養在含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM培養基中，放置于37℃含有5% CO2的細胞培養箱中培養，待生長到約90%時進行相應傳代或接種到96、6孔板中，行后續藥物處理。

1.2.2藥物處理及分組 取對數生長期SH-SY5Y細胞，接種于96或6孔板中，隨機分成4組：對照組、Ghrelin組、6-OHDA組、6-OHDA+Ghrelin組，置于37℃含有5% CO2的細胞培養箱中培養，待細胞長到合適密度，Ghrelin組、6-OHDA+Ghrelin組先給予Ghrelin(1μM)預處理，其他兩組給予相同劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，6-OHDA組、6-OHDA+Ghrelin組2h后給予6-OHDA(400μM)處理，其他兩組給予相同劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，放入培養箱培養24h，后行后續實驗操作。

1.2.3細胞活力測定 將對數生長期細胞接種于96孔板內，置于細胞培養箱中，待細胞生長到合適密度，按上述方法進行藥物處理。在細胞培養箱繼續培養22h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，用錫箔紙包好避光條件下，細胞培養箱孵育2h，孵育結束后用酶標儀450nm處測定吸光度(A)。每組設6個復孔，實驗平行重復3次，計算細胞活力。

1.2.4LDH釋放量檢測[10]取對數生長期細胞接種于96孔板內，置于細胞培養箱中，待細胞生長到合適密度，按上述方法進行藥物處理。培養24h后，收集上清液并轉移到新的96孔板中，按照LDH檢測試劑盒步驟進行操作，反應結束后用酶標儀450nm處測定吸光度(A)。每組設6個復孔，并且設置只加入培養基的空白孔作為空白對照，實驗平行重復3次，LDH釋放率=給藥組LDH活力/空白組LDH活力。

1.2.5線粒體膜電位(ΔΨm)檢測[11]JC-1染色法來檢測ΔΨm在各處理組中的變化。取對數生長期細胞接種于含有黏附載玻片的12孔板中，待細胞生長到合適密度后進行相應藥物處理。24h后，吸去培養基，用PBS洗1次，然后加入JC-1(1x)染色液，避光條件下孵育20min，孵育完成后吸去染色液，用洗滌液洗滌2次，最后放在SP8熒光顯微鏡下觀察拍照，實驗平行重復3次，用Image J分析熒光強度。

1.2.6Bcl-2、Bax蛋白表達檢測[12]取對數生長期細胞接種于6孔板內，置于細胞培養箱中，待細胞生長到合適密度，按上述方法進行藥物處理。培養24h后收集細胞，加入強裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30min，在12000rpm的4℃離心機離心30min，收集上清即為細胞總蛋白。取10μl用BCA法測定蛋白濃度，剩余蛋白按照3∶1加入相應的4×SDS后，在金屬水浴鍋煮蛋白10min，室溫冷卻。隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，孵育一抗稀釋液，4℃過夜。次日TBST溶液洗膜，二抗稀釋液室溫孵育1h。再次洗膜3次，加入ECL溶液，暗室內曝光顯影。實驗平行重復3次，用Image J分析條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Ghrelin對6-OHDA處理的SH-SY5Y細胞活力的影響

為了初步探究Ghrelin對6-OHDA誘導PD體外模型的作用，運用CCK-8檢測各組細胞經處理后的細胞活力變化。首先，為了驗證單獨給予Ghrelin是否會對細胞活力產生影響，分別給予0.01、0.1、1、10μM Ghrelin處理細胞，結果顯示，不同濃度的Ghrelin對細胞活力沒有影響，無毒副作用(圖1A)。隨后我們研究6-OHDA單獨對細胞的毒性作用，結果顯示，6-OHDA以劑量依賴性的方式降低了細胞活力(圖1B)，我們采用400μM的6-OHDA用于后續實驗。最后我們檢測Ghrelin預處理對6-OHDA處理的細胞的影響，如圖1C顯示，0.1、1、10μM Ghrelin改善了6-OHDA介導的細胞活力的下降，我們選擇1μM Ghrelin用于后續實驗。以上結果表明，Ghrelin對6-OHDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞存活存在一定的保護作用。

注：Ghrelin或等劑量PBS提前2h處理細胞，在有或沒有6-OHDA的情況下培養24h，CCK-8實驗檢測細胞活力。(A)單獨給予Ghrelin對細胞活力的影響；(B)單獨給予6-OHDA對細胞活力的影響；(C)Ghrelin對6-OHDA刺激的細胞活力的影響。**P<0.01，***P<0.001 vs 對照組；##P<0.01,###P<0.001 vs 6-OHDA 組

2.2 Ghrelin對6-OHDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞LDH釋放率的影響

與對照組相比，6-OHDA導致LDH的大量釋放，表明發生細胞死亡；而給予Ghrelin預處理后，與6-OHDA組相比，6-OHDA+Ghrelin組LDH的釋放率明顯降低，說明Ghrelin降低了6-OHDA所致的細胞毒性作用。見圖2。

注：(A)按照上述方法處理細胞，LDH試劑盒檢測各組LDH釋放量的變化，進一步反映細胞毒性作用。***P<0.001 vs對照組；##P<0.01,###P<0.001 vs 6-OHDA 組

2.3 Ghrelin對6-OHDA處理的SH-SY5Y細胞ΔΨm的影響

與對照組相比，給與6-OHDA處理后，細胞紅色熒光強度顯著下降，表明ΔΨm下降；而給予Ghrelin預處理后，6-OHDA+Ghrelin組細胞紅色熒光強度明顯增加，ΔΨm顯著上升。表明Ghrelin預處理能部分恢復6-OHDA所致的ΔΨm的下降，具有線粒體保護功能。見圖3。

注：(A-B)按照上述方法處理細胞，JC-1實驗紅、綠熒光強度比值反映ΔΨm的變化。Scale bar = 50 μm。***P<0.001 vs 對照組；###P<0.001 vs 6-OHDA 組

2.4 Ghrelin對6-OHDA誘導損傷的SH-SY5Y細胞Bcl-2和Bax表達的影響

與對照組相比，6-OHDA組Bcl-2/Bax比值降低；而給與Ghrelin預處理后，與模型組相比，6-OHDA+Ghrelin組Bcl-2/Bax的比值明顯升高，表明Ghrelin降低了6-OHDA所致的細胞凋亡反應。見圖4。

注：(A-B)按照上述實驗方法處理細胞，提取細胞總蛋白，運用Western blotting方法檢測Bcl-2和Bax的表達，Bcl-2/Bax的比值反映細胞內凋亡水平。***P<0.001 vs 對照組；##P<0.01 vs 6-OHDA 組

3 討論

PD是一種與年齡有關的中樞神經退行性疾病，威脅人類健康，據統計我國PD患者接近300萬，預計2030年全世界將有900萬PD患者[13]。PD神經元變性的確切機制尚不十分明確，目前PD 的治療主要以左旋多巴替代療法為主，其可以緩解癥狀，但存在一定的不良反應，且無法阻止疾病的發展，而諸如干細胞治療，神經核毀損術和腦深部電刺激術等替代策略均有嚴格的適應證[14]，藥物治療仍然是治療PD的基石,因此開發一種能快速通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的靶向藥物對于PD的治療是十分有益的。

Ghrelin作為一個含28個氨基酸的腦腸肽，可以通過BBB在神經系統疾病發揮保護作用。以往有研究報道，Ghrelin通過與受體結合，發揮抗凋亡、抑制膠質細胞激活，在神經退行性疾病的體內外模型中發揮神經保護作用[8,15-16]。本課題組前期研究結果已經證明Ghrelin可以通過促進自噬、抑制內質網應激、激活ERK1/2等信號轉導途徑對PD的體內外模型發揮神經保護作用[9,17-18]。然而，Ghrelin對6-OHDA誘導的細胞毒性作用及機制仍需要進一步研究。

PD發病機制復雜，既往研究表明，線粒體功能障礙會加重神經元的退變[3]。本文結果顯示，Ghrelin預處理增加了細胞活力，降低了細胞毒性作用。6-OHDA可以抑制線粒體復合體Ⅰ，抑制ATP產生，阻斷細胞內ATP參與的過程，產生大量自由基，從而導致線粒體功能異常，進一步引起細胞死亡[19]。Ghrelin 顯著提高了ΔΨm水平，增加了Bcl-2/Bax的比值，表明Ghrelin降低了6-OHDA所致的線粒體功能損傷和細胞凋亡，有利于線粒體穩態的維持。綜上所述，Ghrelin減輕了6-OHDA所致的SH-SY5Y細胞損傷。我們所有的工作旨在進一步探索Ghrelin的潛在分子機制，同時為Ghrelin成為治療PD的臨床藥物提供了新的證據。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。