苦豆子種子營養成分及其急性毒性

蘇永霞，馮 平，朝克圖，蘇日拉格，路 浩，吳晨晨，趙寶玉

(1. 西北農林科技大學 動物醫學院 中國西部有毒植物研究所，陜西楊凌 712100；2. 榆林學院 生命科學學院，陜西榆林 719000；3. 阿拉善左旗吉蘭泰鎮綜合保障和技術推廣中心，內蒙古阿拉善 750300；4. 阿拉善左旗銀根蘇木綜合保障和技術推廣中心，內蒙古阿拉善 750300)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)俗名苦豆草、苦豆根、歐苦參、草槐等，是豆科槐屬多年生草本植物，主要分布于中國西北干旱半干旱的荒漠化和鹽堿化等地區，面積約為180萬 hm2，資源儲量十分豐富[1-2]。作為傳統藥源植物，苦豆子具有清熱解毒、抗菌消炎和殺蟲等作用，在民間常被用來做止痛劑、抗菌劑和抗風濕劑，用于治療發燒和胃腸疾病[3]。同時，苦豆子地下根莖發達，耐干旱、耐鹽堿、抗風固沙，是一種很好的防風固沙植物，在西北干旱荒漠化地區對維護生態平衡和防止土地沙漠化具有重要生態作用[4]。有研究表明，苦豆子主要含有生物堿、黃酮類、揮發油、脂肪酸、甾體類等多種化學成分，其中生物堿是其主要活性成分，含量較高，且藥理作用研究最為深入[5]。苦豆子全草生物堿含量約為6.11%～8.03%，種子中最高約為8.11%，具有抑菌抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等藥理活性[6-9]。在醫藥方面，以苦豆子生物堿為原料開發的克瀉靈片、婦炎栓、苦參素注射液和苦參素膠囊等制劑，已廣泛用于人醫臨床，用于急慢性腸炎、婦科炎癥以及肝炎等多種疾病的治療；在農業方面，苦豆子可作為有機綠肥、農藥、動物飼料等開發利用[1]。但同時，苦豆子也具有一定的毒性，青綠時期毒性較大、枯萎時毒性較小，在冬春季飼料缺乏時牲畜常因饑餓采食而引起中毒，其中馬屬動物較為敏感，羊、驢等過量采食嚴重者也會引起死亡[10]。鑒于苦豆子在中國資源儲量豐富，并且具有較高的藥用價值和生態功能，因此，人們越來越重視苦豆子的資源保護與開發利用。目前，有關苦豆子資源化利用的研究，主要集中在苦豆子的地上部分，而苦豆子種子營養成分如何，是否有毒性及資源化利用的潛力，研究甚少。本研究擬通過檢測苦豆子種子的營養成分及其對小鼠的急性毒性大小，以期為苦豆子種子的毒性毒理研究和資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本 苦豆子種子于2019年10月采自內蒙古阿拉善吉蘭泰鎮(105°45′30.6″E，39°45′22.6″N)，主要采集成熟期苦豆子莢果，置陰涼通風處晾曬，干燥后經脫痂皮處理獲得苦豆子種子，保存，備用。

1.1.2 試驗動物 昆明系清潔級健康小鼠，雌雄各半，體質量為(20±2)g，購自成都達碩試驗動物中心，飼養室溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，試驗前適應性飼養7 d。

1.1.3 儀器與試劑 EV311旋轉蒸發儀(北京萊伯泰科儀器有限公司)、SHB-Ⅲ循環式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、DLK-5003快速低溫冷卻循環機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、U-3900H型紫外-可見分光光度計(上海美譜達)、L-8900型氨基酸自動分析儀(華美辰)、Z-2000型原子吸收分光光度計(日立)和KJEI-TECTM8400型凱式定氮儀(上海沛歐)等；主要試劑有二氯甲烷、正丁醇、甲醇、濃硫酸、高氯酸、次硝酸鉍等，均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦豆子種子營養成分分析 取陰干的苦豆子種子粉碎，100目篩子過篩，隨后按國標法進行相關營養成分檢測。常規營養成分按GB 14924.3-2010《實驗動物 配合飼料營養成分的測定》、礦物質元素按 GB/T 13885-2017《飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定 原子吸收光譜法》、磷元素按GB 5009.87-2016《食品安全國家標準 食品中磷的測定》、硒元素按GB/T 5009.93-2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》和氨基酸按GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.2.2 苦豆子種子醇浸膏及其生物堿的提取 苦豆子種子陰干粉碎后分裝于圓底燒瓶，加入體積分數為95%工業酒精進行熱回流，回流溫度為72 ℃，時間為4 h，重復上述回流過程4～5次，得到苦豆子醇提液。隨后用旋轉蒸發儀旋蒸濃縮醇提液，得到醇浸膏。浸膏用1 mol/L HCl溶解，抽濾，除去不溶性殘渣，得到酸水液。隨后將酸水液置于分液漏斗，按母液∶二氯甲烷=3∶1的體積比用二氯甲烷反復萃取以除去雜質；萃取后剩余的酸水液用少量固體NaOH調節pH至9～11，依次用二氯甲烷和正丁醇反復萃取，減壓回收溶劑得到堿性二氯甲烷部分和堿性正丁醇部分，二者合并為苦豆子種子生物堿部分。

1.2.3 急性毒性試驗 參照毒理學試驗方法與技術以及LD50計算原則，苦豆子種子醇浸膏以 3 000.00 mg/kg、2 400.00 mg/kg、1 920.00 mg/kg、1 536.00 mg/kg、1 228.80 mg/kg、 983.04 mg/kg和786.43 mg/kg為正式試驗劑量組，苦豆子種子生物堿以800.00 mg/kg、 567.38 mg/kg、402.39 mg/kg、285.39 mg/kg和202.40 mg/kg為正式試驗劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半，逐只稱體質量后灌胃染毒，每10 g體質量給藥量為0.1 mL。在苦豆子種子醇浸膏和生物堿分別灌胃染毒后的1 h內持續觀察小鼠的毒性反應以及死亡情況，包括飲食、排泄物和外觀行為等變化。隨后每隔1 h觀察每組小鼠的毒性反應，并統計24 h內小鼠死亡分布情況。死亡小鼠及時進行解剖，觀察臟器有無病理變化，其他小鼠于試驗結束觀察愈后效果，觀察期為14 d。

1.2.4 結果統計及分析 營養成分檢測時各項目均做3次獨立重復試驗，所得數據用SPSS 20.0進行統計分析，所得結果用“平均數±標準差”表示。急性毒性試驗，采用改良寇氏法分別計算小鼠單次灌胃染毒后苦豆子種子醇浸膏和生物堿的LD50和95%可信限。

2 結果與分析

2.1 苦豆子種子營養成分測定

2.1.1 常規營養成分 由表1可知，苦豆子種子中干物質的含量最高，粗灰分的含量最低。

2.1.2 礦物質元素 如表2所示，苦豆子種子常量元素有Ca、P，K和Mg，其中K含量最高為 7 002.25 mg/kg，Ca和P含量相當，二者的比值為1.1，Mg含量相對較低，為1 416.00 mg/kg。表明苦豆子種子常量元素較豐富，可以作為動物飼料礦物質的來源。微量元素測定結果顯示，苦豆子種子中含有Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se。研究顯示，當Zn/Cu>10及Zn/Fe>1，這些礦物質元素的生物學功能就會發生拮抗作用。苦豆子種子中 Zn/Cu值為4.82，Zn/Fe值為0.25，這2個比值均在合理范圍之內，有利于動物機體的吸收，可以作為動物補充無機礦質元素的飼料來源。Mn、Cr、Se等對機體的糖代謝和蛋白質代謝具有重要作用，苦豆子種子中Mn元素的含量較高，Cr、Se的含量相對較低，但其含量都符合飼料中的允許量，對動物機體具有重要的作用。

表2 苦豆子種子的礦物質元素含量Table 2 Contents of mineral elements in seeds of S.alopecuroides

2.1.3 氨基酸 如表3所示，苦豆子種子中共有17種氨基酸，總含量為17.673%，其中必需氨基酸(EAA)9種，含量為5.780%，占總氨基酸(TAA)的32.705%。非必需氨基酸(NEAA)8種，含量為11.893%，占總氨基酸(TAA)的 67.295%。藥效氨基酸9種，含量為11.704%，占總氨基酸的66.3%。9種必需氨基酸的含量依次為Leu>Lys>Val> Phe>Tyr>Thr>Ile>Met>Cys，8種非必需氨基酸含量依次為Glu>Arg>Pro>Asp>Gly>Ger>Gla>His，9種藥效氨基酸含量依次是Glu> Arg>Asp>Leu>Lys>Gly>Phe>Ile>Met。其中，所有氨基酸中EAA/NEAA=0.49，EAA/TAA=0.33，均接近并低于WHO/FAO提出的理想蛋白質EAA/NEAA=0.60和EAA/TAA=0.40的要求，可見苦豆子種子的氨基酸種類和含量比較豐富，配比較為合理，具有較高的營養價值。

表3 苦豆子種子的氨基酸含量Table 3 Contents of amino acid in seeds of S.alopecuroides

本試驗采用FAO/WHO提出的氨基酸比值系數法對苦豆子種子的氨基酸進行評價[11]。由表4可知，苦豆子種子中蛋氨酸+半胱氨酸值遠低于FAO/WHO推薦的氨基酸模式譜標準，并且其RC值最小為0.25，RC最小者為第一限制性氨基酸，所以蛋氨酸和半胱氨酸為苦豆子種子的第一限制氨基酸。SRC值越接近100，EAAI值接近1，則植物蛋白營養價值越高[11]，本試驗中苦豆子種子的SRC、EAAI分別為59.04和 0.85，所以苦豆子種子可作為理想的植物蛋白來源。

表4 苦豆子種子的氨基酸含量和營養評價Table 4 Amino acid content and nutrition evaluation in seeds of S.alopecuroides

2.2 急性毒性試驗

2.2.1 苦豆子種子醇浸膏 小鼠灌胃染毒后， 3 000.00mg/kg、2400.00mg/kg和1920.00 mg/kg劑量組小鼠在染毒后表現為短暫性安靜，大約在染毒10 min左右，小鼠出現明顯的呼吸系統癥狀和神經系統癥狀。主要表現為呼吸頻率加快以及全身震顫、運動失調、四肢呈劃水狀無法站立，有時還會出現上下跳躍、驚恐不安等情況。神經癥狀明顯的小鼠在1 h內都表現為強直性痙攣后死亡，死亡小鼠解剖可見其臟器器官無明顯的病理損傷，存活小鼠在神經癥狀過后表現為身體蜷縮、精神沉郁，24 h后存活小鼠飲食和精神狀況逐漸恢復正常。1 536.00 mg/kg和1 228.80 mg/kg劑量組小鼠，神經癥狀較前3個劑量組輕，小鼠死亡數也減少。983.04 mg/kg和 786.43 mg/kg劑量組小鼠，染毒后個別小鼠表現為身體蜷縮發抖、精神沉郁，大部分小鼠精神狀態良好。染毒后各組小鼠的急性毒性死亡情況如表5所示，各組小鼠在24 h內存活情況如圖1所示。采用改良寇氏法計算小鼠單次灌胃苦豆子種子醇浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，95%可信限為 1 221.80～1 621.81 mg/kg。

表5 苦豆子種子醇浸膏對小鼠的急性毒性試驗結果Table 5 Acute toxicity result of extract from S.alopecuroides seeds to mice

2.2.2 苦豆子種子生物堿 小鼠灌胃染毒后，800.00 mg/kg和567.38 mg/kg劑量組小鼠在染毒后10～20 min左右出現明顯的臨床癥狀，外觀行為以及死亡情況與灌胃高劑量苦豆子種子醇浸膏后的表現相似。其他3組低劑量組小鼠，給藥后表現為焦躁不安與精神沉郁、安靜交替出現，極少部分小鼠表現為上下跳躍等神經癥狀，大部分小鼠在神經癥狀過后能正常飲食、運動，愈后效果良好。給藥后各組小鼠的急性毒性死亡情況如表6所示，各組小鼠在24 h內存活情況如圖2所示。采用改良寇氏法計算小鼠單次灌胃苦豆子種子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，95%的可信限為346.74～501.19 mg/kg。

表6 苦豆子種子生物堿對小鼠的急性毒性試驗結果Table 6 Acute toxicity result of alkaloids from S.alopecuroides seeds to mice

3 討 論

苦豆子全草中苦豆子種子的產量極高，但是目前對于苦豆子種子的資源化利用研究報道較少。本研究結果顯示，苦豆子種子中粗蛋白含量為25.19%、粗脂肪為4.46%、粗纖維為 20.22%，紫花苜蓿素有“牧草之王”的美稱，其粗蛋白、粗脂肪和粗纖維的含量分別為26.1%、 4.5%和17.2%，通過與其比較，苦豆子種子粗蛋白、粗脂肪的含量與紫花苜蓿相當，粗纖維的含量比紫花苜蓿稍高；與矮象草、黑麥草和草木樨等牧草相比，苦豆子粗蛋白的含量比這些牧草高很多，粗纖維的含量比這些牧草低[12]。而牧草的營養價值在很大程度上取決于其粗蛋白和粗纖維的含量，飼料中的粗蛋白可為動物提供營養，粗纖維有助于減少動物瘤胃臌氣，促進動物消化，苦豆子種子中粗蛋白含量較高、粗纖維含量適中，所以苦豆子作為飼料具有很大的利用潛力。此外，研究表明[13]苦豆子提取生物堿后剩余的籽渣和草渣中含有較高的蛋白質和微量的生物堿，用其廢渣飼喂羊只，不僅具有抑制腸道有害細菌的作用，還能促進飼料的消化吸收，加快羊只生長，有助于干旱地區畜牧業的發展。

礦物質元素對動物機體具有重要的作用，其含量過多或缺乏都會對動物機體的生長發育造成影響。苦豆子種子中含有Ca、P、K、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se等多種礦物質元素，其中Ca含量為2 587.50 mg/kg，P為2 353.50 mg/kg，Ca、P比值為1.1，研究顯示羊飼糧中Ca、P比例在 1～2∶1較為適宜，Ca含量過高或過低都會影響其他礦物質元素的吸收，而Fe與血紅蛋白的合成和多種酶的活性有關[14-15]。有文獻報道[14]，飼料中Cu含量缺乏會引起羔羊蹣跚，含量過多還會引起流涎、腹瀉等中毒癥狀，Zn元素對公羊睪丸中精子的形成和羊毛的生長具有重要作用，苦豆子種子中Fe、Cu、Zn的含量都符合美國 NRC推薦的綿羊飼糧中礦物質的需求量，并且苦豆子種子的Zn/Cu值為4.82，Zn/Fe值為0.25，這兩者的比值都較為合理，在動物利用過程中不會發生拮抗作用。苦豆子種子中還含有微量的Cr、Se，這兩種元素對增強動物免疫力和抗氧化具有重要的作用。

本研究中，苦豆子種子含有17種氨基酸，總氨基酸含量為17.673%，與紫花苜蓿總氨基酸含量14.85%～19.48%相當，說明其具有較高的營養價值[16]。苦豆子種子的必需氨基酸中，蛋氨酸+胱氨酸低于標準模式譜較多，是苦豆子種子的第一限制氨基酸，其他各種必需氨基酸較接近或高于模式譜標準值，表明苦豆子種子的氨基酸相對均衡合理。此外，苦豆子種子的藥效氨基酸種類豐富，含量為66.2%，說明苦豆子種子可能還具有一定的藥用價值，其氨基酸含量較高的主要有Glu、Arg、Pro和Asp，Glu具有促進紅細胞生成、改善腦細胞營養及活躍思維作用，Asp酸有治療肝臟和膽汁分泌障礙的功能，Arg可有效提高免疫力等作用[17]。

急性毒性試驗結果顯示，苦豆子種子醇浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，95%可信限為 1 221.80～1 621.81 mg/kg，苦豆子種子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，95%的可信限為 346.74～501.19 mg/kg。苦豆子種子醇浸膏和生物堿分別灌胃染毒后，小鼠都會出現明顯的神經興奮和呼吸系統癥狀，且高劑量組出現神經癥狀的大部分小鼠都會表現出強直性痙攣后死亡，低劑量組小鼠在神經癥狀過后，能正常飲食和運動，愈后效果良好，說明試驗過后苦豆子對小鼠的持續性影響較小。本試驗中小鼠的神經癥狀和呼吸系統癥狀明顯，說明苦豆子對小鼠的毒作用靶器官可能是腦和肺臟，余建強等[18]研究表明，槐定堿對中樞神經系統具有明顯的興奮作用，曹曉東等[19]研究顯示，小鼠經口攝入苦豆子總堿后，主要損傷的器官是肺臟和腦，從而引起這些器官的機能代謝障礙，這與本試驗結果一致。有資料記載[20]苦豆子槐果堿主要作用于神經系統和心血管系統，低劑量時對神經系統有抑制作用，高劑量時則表現為興奮，而在本試驗中苦豆子浸膏和生物堿的低劑量組小鼠主要表現為精神沉郁，高劑量組小鼠主要表現為全身震顫、上下跳躍以及精神亢奮等神經癥狀，可能與苦豆子總堿中含有槐果堿有關。此外，苦豆子種子醇浸膏和生物堿分別染毒后，小鼠的臨床癥狀表現相似，說明苦豆子中的主要毒性成分為生物堿，因此苦豆子在提取生物堿后可以安全利用。根據 WHO口服外源毒物分級標準[9]，本試驗測得苦豆子種子浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，具有低等毒性，苦豆子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，具有中等毒性。

以上結果表明，苦豆子種子中含有較高的粗蛋白和粗纖維，并且富含多種礦物質元素和氨基酸，配比較為合理，可以作為家畜的蛋白質補充飼料。但通過急性毒性試驗，發現其種子中含有的生物堿具有中等毒性，家畜直接采食會產生毒害作用，因此苦豆子需脫毒處理后才能作為動物蛋白質的補充飼料。