向日葵核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核菌絲型萌發特性

唐仕娟，劉 佳，郭子坤，石成才，王智飛，張樹武，徐秉良

(甘肅農業大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

向日葵(HelianthusannuusL.)由于其籽實含油量高及其秸稈可作為生物能源，已成為世界第四大油料作物[1-3]，全世界年產量達4734.5萬t，中國種植總面積為95.902萬hm2。由于諸多病害的發生，向日葵產業發展受到嚴重限制，其中由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病是造成向日葵產業經濟損失的主要病害之一，世界各地向日葵種植區均有發生[4]。研究表明，核盤菌可以侵染向日葵葉片、莖基部、根部和花盤等部位，花盤受害后品質下降，產量降低，損失嚴重[5-6]。據報道，在中國向日葵菌核病發生地塊，一般可減產30%左右[7]。民勤縣作為甘肅省向日葵主栽區，近年來菌核病發生愈來愈嚴重，如2016年該病導致民勤縣向日葵減產10%～30%，個別嚴重地塊減產高達80%[8]。

研究表明，菌核作為向日葵菌核病菌度過不良環境的重要形態[9]和主要初侵染源，在干旱土壤中可存活8a之久[10]。Hao等[11]發現菌核侵染寄主的主要方式有直接萌發形成菌絲體侵入植物內部，以及萌發形成子囊盤后釋放出子囊孢子，并借助媒介侵入寄主植物。有關菌核萌發形成子囊盤的報道較多，于淑怡等[12]研究表明，溫度和濕度適宜時菌核可萌發出子囊盤柄，光照條件下菌核可萌發形成成熟的子囊盤。Mila等[13]研究表明，土壤中的水分是影響菌核子囊盤型萌發的重要因素，土壤干燥時菌核無法萌發形成子囊盤。Nepal等[14]研究表明菌核吸水量與其子囊盤的萌發密切相關，當含水量較高時，菌核的萌發率越大，形成子囊盤數量也越多。同時，菌核可直接萌發形成菌絲侵入植物內部，韓月泠等[15]發現人參核盤菌菌核在自然條件下容易直接萌發出菌絲，但未吸收水分時無法萌發形成菌絲，土壤濕度對其萌發菌絲影響較大。母紅巖等[16]發現土壤濕度越小、菌核齡期越大越不利于其直接萌發形成菌絲。Huang等[17]研究發現菌核土壤中進行菌絲萌發，產生的菌絲可以感染向日葵幼苗的根和下胚軸，而其花盤部分感染是由子囊孢子引起的。另外，在自然環境中菌核形成極易受濕度、溫度和通風情況等環境因素影響[18]，營養、光照和pH等條件是齊整小核菌菌核形成的關鍵因素[19]。

影響向日葵菌核病菌菌核萌發特性及菌核形成的主要因素尚未報道，本研究以從甘肅民勤向日葵種植地區分離的核盤菌形成的菌核為研究對象，探究不同條件對向日葵菌核菌絲型萌發和菌絲型萌發后形成菌核的影響，旨在為菌核病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

將采集、分離自甘肅民勤并保存于甘肅農業大學植物保護學院植物病毒學與分子生物學實驗室的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)接種于PDA平板中央活化培養2 d后(25 ℃恒溫培養箱，12 h/d光照培養)，挑取培養基邊緣菌絲轉接于新的PDA平板，待培養14 d后(菌核成熟)挑選大小一致菌核取出晾干，室溫保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 菌核消毒處理 菌核用75%酒精浸泡 15 s，轉移至4%NaClO溶液浸泡3 min，無菌水重復漂洗3次，無菌濾紙吸干表面水分，收集， 備用。

1.2.2 溫度對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量影響 將消毒處理的菌核接種于PDA培養基中央，每皿接種1個菌核，并分別置于溫度為5、10、15、20、25、30、35和40 ℃培養箱中黑暗培養。待培養3 d后，觀察菌核萌發形成菌絲的情況，每隔1 d測量菌落直徑，培養14 d后記錄菌核數量。每個處理3皿，重復3次。

1.2.3 pH對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量影響 制備pH分別為4、5、6、7、8、9和10的PDA培養基，將菌核接種于不同pH PDA培養基中央，每皿接種1個菌核。置于光照培養箱(溫度為25 ℃、光照時長為12 h/d)培養。菌核萌發、菌落直徑及菌核數量記錄方法同“1.2.2”，每個處理3皿，重復3次。

1.2.4 不同光照條件對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量影響 將菌核置于 PDA 培養基中央，每皿接種1個菌核，分別置于不同光照條件培養(24 h/d光照、0 h/d光照、12 h/d光照、紫外照射2 h+24 h/d光照、紫外照射2 h+0 h/d光照)。菌核萌發、菌落直徑及菌核數量記錄方法同“1.2.2”，每個處理3皿，重復3次。

1.2.5 不同碳源、氮源對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量影響 根據Czapek培養基的配方，按照相同的比例加入不同種碳源，分別以蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇作為碳源，以硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硝酸鉀、蛋白胨和氯化銨作為氮源制備不同碳源和氮源培養基，并以不添加碳源、氮源培養基作為對照。然后，將備用菌核置于 PDA 培養基中央，每皿接種1個菌核，置于培養箱(溫度為25 ℃、光照時長為12 h/d)培養。菌核萌發、菌落直徑及菌核數量記錄方法同“1.2.2”，每個處理3皿，重復3次。

1.2.6 溫度對菌核致死活性的影響 采用恒溫水浴處理法測定溫度對菌核致死活性的影響。將菌核置于裝有5 mL無菌水的10 mL無菌離心管中，并利用水浴鍋對其進行不同溫度處理，處理溫度分別為45、50、55、60、65、70、75和80 ℃，處理時間為10 min。經處理后置于無菌濾紙晾干，并接種于PDA平板中央，每皿接種1個菌核，每個處理5皿。分別置于25 ℃、光照時長為12 h/d的培養箱中培養，培養3 d后觀察菌核萌發情況，每隔1天觀察1次，連續觀察7 d。

1.3 數據處理和分析

采用Excel 2010整理數據并繪制圖表，采用SPSS 21.0軟件和Duncan’s新復極差法進行統計分析及多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 溫度對菌核菌絲型萌發后菌落生長及菌核產生量影響

結果表明，在5～30 ℃時菌核均可進行菌絲型萌發，最適宜菌核菌絲型萌發和菌絲生長的溫度為20～25 ℃，培養6 d后菌核萌發菌絲形成的菌落直徑均可達85 mm。溫度對形成的菌核大小和數量均有影響，在適宜溫度范圍內培養形成的菌核數量較多，其中25 ℃下培養所形成的菌核數最多。當溫度低于20 ℃時形成的菌核數量會減少，然而，形成的菌核較大，直徑可達6 mm左右；當培養溫度為30 ℃及以上時無法形成菌核(表1)。

表1 不同溫度下菌核菌絲型萌發及形成菌核情況Table 1 Germination of hyphae from sclerotia and sclerotia formation of S.sclerotium at different temperatures

2.2 pH對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量的影響

培養基pH在4～10時菌核均可進行菌絲型萌發，且隨著pH增大，菌核萌發時間越長，菌落生長速度越慢(圖1-A)。培養基pH在4～9時菌核萌發菌絲后均可形成菌核，且隨著pH的增大形成的菌核數逐漸減少。當培養基pH為4時形成的菌核最多，且與pH ≥ 5的處理間均存在顯著差異，pH為10時，菌核萌發菌絲后無法形成菌核(圖1-B)。

2.3 光照對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量的影響

光照時長對菌核菌絲型萌發及菌核形成有顯著影響，光照時間越長菌核萌發后菌絲生長速度越快，在24 h/d光照培養時，菌落生長速度最快，黑暗培養的菌落生長最慢。紫外照射對菌核的菌絲型萌發無顯著抑制作用(圖2-A)。24 h/d光照培養形成的菌核數量最多，平均每皿可形成18個菌核，與其他處理間差異顯著。紫外照射后形成的菌核數略少于未經紫外照射的處理(圖2-B)。

2.4 碳源對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量的影響

結果表明，添加不同種類的碳源對菌核菌絲型萌發活性和萌發后菌核的形成有顯著影響。培養4 d、5 d和6 d后，與對照相比，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖做碳源時，菌核萌發后菌落直徑均與對照差異顯著(圖3-A)。添加乳糖作為碳源時，形成的菌核最多，平均每皿可形成14個菌核，顯著高于添加其他碳源。然而，添加甘露醇為碳源時，形成的菌核數量與對照相比無顯著差異，均形成少量菌核(圖3-B)。

2.5 氮源對菌核菌絲型萌發活性及菌核產生量的影響

結果表明，氮源的種類對菌核菌絲型萌發活性和萌發后菌核的形成有顯著影響。蛋白胨是最適宜菌核萌發后菌落生長的氮源，且在培養4 d和5 d 后，形成的菌落直徑顯著高于其他組處理，而尿素作為碳源時，菌落直徑均顯著小于其他組處理(圖4-A)。添加硝酸銨為氮源時形成的菌核最多，平均每皿可形成24個菌核，形成的菌核數量顯著高于其他處理。不添加氮源時無法形成菌核，添加尿素為碳源時，形成的菌核數量與對照間無顯著差異，僅形成少量菌核(圖4-B)。

2.6 溫度對菌核致死活性的影響

結果表明，不同溫度處理后培養7 d對菌核致死活性具有顯著影響，其中當水浴處理溫度為45 ℃和50 ℃時，菌核萌發形成的菌落直徑達85 mm。水浴處理溫度大于50 ℃對菌核的萌發具有顯著影響，在水浴處理溫度為55 ℃、60 ℃、 65 ℃和70 ℃時，菌落直徑分別為25.83 mm、20 mm、12.33mm和0 mm，顯著小于45 ℃和50 ℃處理后培養的菌落直徑，尤其當溫度為70 ℃處理10 min時，菌核未能萌發形成菌絲(圖5)。

3 結論和討論

本研究發現在5～30 ℃時菌核均可進行菌絲型萌發，最適宜其萌發的溫度為20～25 ℃，35 ℃及以上溫度培養時，菌核無法進行菌絲型萌發，且10 ℃及以下溫度培養時，菌核萌發菌絲較慢，培養5 d才可見菌核萌發形成菌絲。母紅巖等[16]研究表明油菜菌核菌絲型萌發的最適溫度為20～27.5 ℃，10 ℃以下和30 ℃以上均不利于菌核進行菌絲型萌發，與本研究結論基本一致。李國慶等[12]研究表明，不同溫度下生長的菌核萌發具有多樣性，本研究中溫度對菌核菌絲型萌發的速度和萌發后形成的菌核數量及大小有顯著影響。本研究中低溫下菌核可進行菌絲型萌發，而母紅巖等[16]的研究中，在第11天時，10 ℃培養的菌核未見萌發，這可能與菌核的來源和本研究為菌核提供營養刺激(即在培養基上培養)有關。

有研究[20]表明，核盤菌分泌的草酸是其致病過程中的重要因子，為核盤菌侵染提供酸性環境，因而核盤菌對pH的適應能力較為廣泛。本研究發現菌核菌絲型萌發對pH的適應范圍也較為廣泛，在培養基pH為4～10時菌核均可進行菌絲型萌發，酸性條件更有利于菌核進行菌絲型萌發，這與母紅巖等[16]研究結果一致。隨著pH增大，菌核數量越來越少，當培養基pH為10時，菌核進行菌絲型萌發后無法再形成菌核，這與Rollins 等[21]報道堿性條件下菌核形成受到抑制的結論一致。

劉勇等[22]研究報道，紫外線照射能夠刺激菌核子囊盤型萌發，本研究中發現紫外光照射對菌核的菌絲型萌發沒有顯著刺激作用。同時本研究發現光照時間越長菌核越容易進行菌絲型萌發。相關研究表明菌核的堅固結構可以抵御外界不良環境，例如：紫外線照射、高溫、干旱等[23]，本研究發現紫外光照射2 h后菌核仍可進行菌絲型萌發，這可能與菌核的結構有關。

關于碳源和氮源對菌核菌絲型萌發的研究較少，本研究中培養基不添加碳源和氮源時菌核均能進行菌絲型萌發，但不添加碳源或氮源時，幾乎無法形成菌核。部分碳源和氮源會抑制菌核菌絲型萌發后形成菌核，如甘露醇和尿素，其原因有待進一步研究。另外，菌核對不良環境因素有一定的耐受力，本研究中向日葵菌核的致死溫度高達70 ℃(水浴10 min)，與王瑋[24]研究的辣椒菌核病菌形成菌核的致死溫度相同。因此，本研究明確了不同溫度、pH、光照條件、碳源和氮源對向日葵菌核菌絲型萌發的影響，但其他因素促使菌核菌絲型萌發的條件和機理有待進一步研究。