蘋果樹腐爛病菌分隔蛋白基因 VmImp2的功能研究

李 晨，吳 楠 ，劉召陽 ，高宇琪，黃麗麗，馮 浩

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

PCH(Pombe Cdc15homology)蛋白能夠通過連接細(xì)胞骨架元件與細(xì)胞膜參與很多生物學(xué)過程，如胞質(zhì)分裂、囊泡運(yùn)輸、胞吞胞吐等[1]。該類蛋白主要包括N末端的FCH(Fes/CIP homology,F-BAR)結(jié)構(gòu)域和C末端的SH3(Src Homology3)結(jié)構(gòu)域。其中，F(xiàn)CH結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)連接細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架，促進(jìn)膜彎曲，導(dǎo)致膜內(nèi)陷或突出[2-6]。SH3結(jié)構(gòu)域可以募集其他配體蛋白，維持收縮環(huán)的穩(wěn)定[7]。Imp2是PCH蛋白家族的成員之一，其F-BAR結(jié)構(gòu)域在參與胞質(zhì)分裂過程中，在收縮環(huán)收縮和分解中起到至關(guān)重要的作用[8]。目前研究表明，Imp2可以與兩個(gè)含有F-BAR結(jié)構(gòu)域蛋白Cdc15和Rga7協(xié)同作用參與收縮環(huán)的組裝、收縮以及分解，以確保正常的胞質(zhì)分裂[9]。Imp2的SH3結(jié)構(gòu)域能夠與其配體通過特定的相互作用形成一個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定收縮環(huán)。這種相互作用的破壞會(huì)改變蛋白質(zhì)募集的時(shí)間和完整性，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂等活動(dòng)[7]。Imp2的SH3結(jié)構(gòu)域除維持收縮環(huán)的穩(wěn)定外，還能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞高爾基體和液泡的功能參與真菌的膜轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。

蘋果樹腐爛病(AppleValsacanker)是由黑腐皮殼屬真菌Valsamali引起的重要枝干病害[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病菌基因組中存在VmImp2，且該基因的表達(dá)受到病菌miRNA的調(diào)控，推測(cè)其在蘋果樹腐爛病菌的生長(zhǎng)、繁殖及致病過程中發(fā)揮重要作用。為此，本試驗(yàn)對(duì)VmImp2的功能進(jìn)行研究，為進(jìn)一步明確腐爛病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料及載體 蘋果樹1 a生枝條采自陜西省咸陽市乾縣盤洲村富士蘋果(Malusdomesticaborkh cv.‘Fuji’)。蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果樹病害綜合防控實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基，用于載體構(gòu)建。pFL2質(zhì)粒(含有抗G418的neo基因)以及pDL2質(zhì)粒(含抗潮霉素的hph基因)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒和PCR凝膠回收試劑盒均購于OMEGA公司；TaqDNA聚合酶購于康為試劑公司；Fast Pfu DNA聚合酶購于北京全式金生物科技有限公司；潮霉素及氨芐青霉素購于MP公司；裂解酶(Lysing Enzyme)及崩潰酶(Drisealase)購于Sigma公司；限制性內(nèi)切酶購于Thermo公司；引物合成和測(cè)序由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 VmImp2基因生信分析

通過NCBI網(wǎng)站下載VmImp2蛋白同源序列，用MEGA7軟件以極大似然法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。同時(shí)用SMART軟件對(duì)Imp2蛋白序列進(jìn)行初步分析。

1.3 基因組DNA提取

將活化好的野生型菌株03-8接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上，25℃暗箱培養(yǎng)3 d后，使用百泰克真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌絲基因組DNA。將提取成功的菌絲DNA用分光光度法進(jìn)行純度與濃度的檢測(cè)。

1.4 VmImp2基因敲除和Δ VmImp2突變體鑒定

參考蘋果樹腐爛病菌的全基因組數(shù)據(jù)[14]，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物1F/2R與3F/4R，分別擴(kuò)增VmImp2基因的上下游片段(2 000 bp左右)。其中引物2R和3F的5′端帶有與neo同源序列。以質(zhì)粒pFL2為模板，以NeoF和NeoR為引物擴(kuò)增neo基因。同時(shí)設(shè)計(jì)巢式引物CF/CR。利用Double-joint PCR的方法構(gòu)建敲除載體，詳細(xì)步驟參考Yu等[15]的方法。根據(jù)同源重組的原理，將構(gòu)建好的敲除載體，通過PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入配置好的原生質(zhì)中。詳細(xì)步驟按照高靜等[16]的方法進(jìn)行，利用含有125 μg/mL的G418培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并通過四對(duì)檢測(cè)引物5F/6R、G418F/G418R、7F/G418R、G418F/8R對(duì)候選突變體進(jìn)行檢測(cè)。5F/6R引物用于檢測(cè)VmImp2基因是否存在，G418F/G418R引物用于檢測(cè)neo片段是否插入，7F/G418R引物和G418F/8R引物分別用于檢測(cè)VmImp2基因的上下游是否發(fā)生同源重組替換。

1.5 VmImp2基因回補(bǔ)及回補(bǔ)突變體鑒定

用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)回補(bǔ)引物HF/HR(表1)。以野生型菌株03-8基因組DNA為模板，擴(kuò)增包含VmImp2基因上游1 500 bp(包含VmImp2基因啟動(dòng)子序列)以及VmImp2基因全長(zhǎng)的片段，通過XhoI酶切后，連接到含有潮霉素抗性的pDL2載體上。利用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建成功的回補(bǔ)載體導(dǎo)入基因缺失突變體中，用含有100 μg/mL潮霉素的PDA平板篩選回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子，并通過PCR檢測(cè)陽性轉(zhuǎn) 化子。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 表型分析

生長(zhǎng)速率測(cè)定：分別將野生型菌株03-8與突變體接在PDA平板上，在25℃暗箱培養(yǎng)48 h后，觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)，并用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

繁殖體形成分析：將野生型菌株及突變體菌株放置于25℃暗箱培養(yǎng)5 d后，轉(zhuǎn)移至25℃，光暗交替的條件下(即光照處理12 h/d，黑暗處理12 h/d)，繼續(xù)培養(yǎng)16 d，共培養(yǎng)21 d后觀察繁殖體產(chǎn)生情況。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

致病力測(cè)定：參考韋潔玲等[17]的方法。將富士蘋果枝條清洗消毒后，燙傷法制造傷口，將活化好的缺失突變體和回補(bǔ)菌株分別接在枝條傷口處，以野生型03-8作為對(duì)照，25 ℃下保濕培養(yǎng)， 3 d后測(cè)量病斑大小并記錄數(shù)據(jù)。每組9根枝條，共3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VmImp2基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

VmImp2共編碼1 487個(gè)氨基酸，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為FCH結(jié)構(gòu)域，SH3結(jié)構(gòu)域和Seipin結(jié)構(gòu)域(圖1)。FCH和SH3結(jié)構(gòu)域是PCH蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂。利用MEGA7對(duì)VmImp2蛋白與其他真菌的Imp2同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，蘋果腐爛病菌(V.mali)與黑腐皮殼屬 (V.spp.)，梨孢屬(Pyriculariaspp.)，炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)的親緣關(guān)系較近，其中與梨腐爛病菌(V.pyri)親緣關(guān)系最近(98.11%)。

2.2 VmImp2基因的敲除和回補(bǔ)

為了闡明蘋果樹腐爛病菌中VmImp2基因的基本生物學(xué)功能，利用野生型菌株03-8進(jìn)行VmImp2基因的敲除與回補(bǔ)。根據(jù)同源重組原理(圖2-A)，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系，獲得大量轉(zhuǎn)化子。對(duì)這些轉(zhuǎn)化子用4對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VmImp2-11、VmImp2-12、VmImp2-70、VmImp2-104和VmImp2-166轉(zhuǎn)化子中5F/6R引物無法檢測(cè)到條帶；G418F/G418R引物能夠檢測(cè)到條帶；7F/G418R以及G418F/8R也能檢測(cè)到正確條帶(圖2-B)。說明敲除載體與VmImp2發(fā)生同源重組，替代了VmImp2在基因組的位置。同時(shí)，將構(gòu)建成功的回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入缺失突變體VmImp2-70中，用檢測(cè)引物5F/6R對(duì)回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有3個(gè)轉(zhuǎn)化子能夠檢測(cè)到條帶，分別命名為VmImp2C-10、VmImp2C-26和VmImp2C-30(圖2-C)。

2.3 VmImp2對(duì)菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

為明確VmImp2對(duì)菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響，將野生型菌株03-8、缺失突變體菌株以及回補(bǔ)菌株分別放置在25℃黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)并測(cè)量菌株直徑。結(jié)果顯示，與野生型03-8相比，缺失突變體菌株的生長(zhǎng)速率明顯下降，菌絲更加稀疏(圖3-A，3-B)。回補(bǔ)菌株與野生型相比無明顯變化(圖3-C，3-D)。

2.4 VmImp2對(duì)病菌繁殖體產(chǎn)生的影響

將菌株光暗培養(yǎng)21 d后觀察繁殖體產(chǎn)生情況并統(tǒng)計(jì)繁殖體數(shù)量。與野生型03-8相比，缺失突變體菌株繁殖體產(chǎn)生受到顯著影響，幾乎不能產(chǎn)生繁殖體(圖4-A)。野生型菌株平均繁殖體產(chǎn)生數(shù)量為144個(gè)，缺失突變體相較于野生型，繁殖體產(chǎn)生數(shù)量平均下降97%以上(圖4-B)，回補(bǔ)菌株的繁殖體產(chǎn)生情況基本恢復(fù)到野生型水平(圖4-C，4-D)。

2.5 VmImp2對(duì)病菌致病力的影響

為明確VmImp2敲除對(duì)病菌致病力的影響，分別將野生型03-8、VmImp2缺失突變體、回補(bǔ)菌株接種到蘋果枝條上，3 d后觀察侵染情況并測(cè)量病斑大小。野生型03-8病斑平均直徑為 31.36 mm，VmImp2缺失突變體致病力比野生型致病力平均下降93%以上(圖5-A，5-B)。回補(bǔ)菌株平均病斑直徑為30.1 mm，致病力基本恢復(fù)到野生型水平(圖5-C，5-D)。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞分裂過程是真菌進(jìn)行無性繁殖的重要方式，對(duì)于真菌的形態(tài)建成至關(guān)重要。在真菌中，胞質(zhì)分裂以及隔膜形成需要肌動(dòng)蛋白環(huán)的收縮和隔膜組裝[18]。有研究[19]表明，Imp2蛋白在參與細(xì)胞分裂過程中有重要作用。在裂殖酵母中，Imp2蛋白在分裂后期調(diào)控收縮環(huán)的收縮與分解。當(dāng)Imp2蛋白被敲除后，在細(xì)胞分裂過程中，收縮環(huán)不能正常的工作與分解，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[8，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘋果腐爛病菌的Imp2蛋白被敲除后，缺失突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的確受到較大影響，但并沒有完全停止生長(zhǎng)。這可能是因?yàn)樵谑湛s環(huán)上不止有Imp2一個(gè)蛋白在行使分裂功能。在裂殖酵母中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Imp2、Cdc15與Rga7三種PCH蛋白家族成員共同參與收縮環(huán)的組裝、收縮以及分解過程，在功能上有一定冗余[9，20]。然而，與Imp2同屬一個(gè)蛋白家族的Cdc15與Rga7，雖然能夠?qū)mp2的功能進(jìn)行補(bǔ)償，但是，它們?cè)诩?xì)胞周期中的功能還存在一定差異[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)相比，缺失突變體菌株幾乎喪失產(chǎn)生繁殖體的能力。蘋果樹腐爛病菌的分生孢子是有隔膜的鏈狀分枝[21]，缺失突變體菌株會(huì)影響正常的胞質(zhì)分裂，進(jìn)而影響分生孢子隔膜形成，使缺失突變體產(chǎn)生繁殖體的能力喪失。也說明相對(duì)于對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段菌絲分裂的影響，Imp2可能對(duì)病菌繁殖體的正常產(chǎn)生影響更大。

致病力分析發(fā)現(xiàn)，與野生型03-8相比，缺失突變體菌株對(duì)枝條的侵染能力基本喪失。一方面是因?yàn)槿笔mp2蛋白影響菌絲的正常分裂生長(zhǎng)，造成致病力下降。另一方面也可能是因?yàn)镮mp2的SH3能夠參與真菌的膜轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。缺失Imp2蛋白后，病菌產(chǎn)生的致病因子果膠酶，毒素等[22-25]大量致病因子分泌受到阻礙，降低對(duì)蘋果枝條的致病力。

目前，對(duì)于Imp2蛋白的研究多集中在裂殖酵母中，并且主要研究Imp2蛋白對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)程的影響。與前人研究Imp2蛋白的生理功能相比，本研究首次明確蘋果樹腐爛病菌分隔蛋白基因VmImp2不僅能夠影響菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)以及繁殖體形成外，還參與病菌的致病過程，能夠顯著降低病菌的致病力，為進(jìn)一步明確腐爛病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。