紅三葉異黃酮在刈割6 h內的變化規律

馮紀銘，何春燕，劉 權，齊 開，莫海鳳

(蘭州大學 草地農業科技學院，蘭州大學草業科學國家級實驗教學中心，蘭州 730020)

刈割是牧草常見的生產方式，能有效提高單位面積牧草產量，但會對植物體造成機械傷害，導致植物體內氧自由基的大量增加，造成膜脂過氧化，影響植物生長[1-3]。牧草在受到外界干擾的情況下具有補償性和均衡性生長的特性，刈割正是通過牧草的這一特性來提高牧草產量[4-5]，因此，刈割管理需尋求外界干擾和自我補償的平衡點。針對不同牧草、不同種植區域，此前開展了大量關于刈割時期、頻次與強度等因素對牧草產量和品質影響的研究。研究結果表明，適當刈割能夠提高牧草生產力，且可以通過提升牧草中粗蛋白和粗灰分含量，降低酸性洗滌纖維含量，改善牧草品質[6-7]。植物體能夠通過調節其生理生化物質含量及活性，清除體內的過量自由基，維持其正常的生命活動。然而，當前關于牧草在受到刈割后短時間內生理生化指標的變化及其再生機理的研究相對較少。

紅三葉(TrifoliumpratenseL.)為優良的豆科牧草[8]，在世界范圍內廣泛種植。其植物體中含有大量的異黃酮類化合物[9]，被用于治療女性更年期綜合癥[10]、緩解抑郁焦慮情緒[11]；作為飼料，可以促進家畜的生長，提高家畜的屠宰性能，提高家畜產品的品質[12-13]。紅三葉中異黃酮類化合物主要為鷹嘴豆素A、芒柄花素、染料木素和大豆苷元[14-15]，具有良好的抗氧化活性，能夠清除氧自由基[16-17]，是植物抗逆過程中的物質基礎。此外，異黃酮類化合物是該植物群落的競爭武器，具有植物毒活性，對紅三葉的生態競爭具有重要作用[18]。

當前，刈割方面的研究主要集中在刈割頻次、留茬高度與產量的關系。有研究表明，在豆禾混播草地中，禾草混播比例75%、施氮肥和磷肥均為0.15t/hm2、每年刈割3次的產量最高[19]。在紅三葉和黑麥草混播草地中，紅三葉產量變化明顯，且其變化主導總產量的變化，相對較低的留茬和較高的刈割頻次均使得紅三葉產量增加[20]，在紅三葉與鴨茅的混播草地中的研究結論與之相同[21]。因此，當前關于紅三葉刈割的研究主要基于草地生產力，關于紅三葉刈割后短時間內應激機理的研究還未見報道。

本研究以‘炫麗’(T.pratensecv. ‘Brilliant’)和‘海發’(T.pratensecv.‘Haifa’) 紅三葉為研究對象，進行間隔3h的3次連續刈割，通過分析異黃酮總含量及4種異黃酮類化合物含量隨刈割次數的變化情況，研究在6h內紅三葉植物體內異黃酮含量響應刈割刺激的變化規律，為生產中以異黃酮生產為目的紅三葉收獲方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

‘海發’和‘炫麗’紅三葉種植于蘭州大學榆中校區智能溫室，在初花期對其進行刈割。紅三葉在盛花期代謝旺盛，異黃酮含量較高[8]，但葉量下降極為明顯，因此本試驗參考生產實際，選擇在初花期進行刈割[22]。

第1次刈割保留地上20 cm，第2次刈割保留地上5 cm，第3次齊地刈割，每次刈割間隔3 h，3個重復。刈割所得地上部分分離莖稈和葉片，其中第3 次刈割僅得莖稈部分。所得樣品在60 ℃下烘干，粉碎，備用。第1 次刈割收集的樣品為植物處于未受到刈割的狀態，并以此作為后2 次刈割處理的對照。

1.2 方 法

1.2.1 異黃酮總含量測定 取11.9 mg芒柄花素溶于10 mL體積分數70%的乙醇，取0.5 mL稀釋至10 mL，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0、3.0 mL于9個10 mL容量瓶中，定容，用紫外分光光度計測定275 nm處吸光值，得回歸方程：y=19.487x+0.0159，R2=0.999 5，x表示異黃酮溶液濃度，y表示吸光度值。

分別取0.1 g 3 次刈割所得莖稈、葉片的試樣于離心管中，加體積分數40%的乙醇10 mL，50 ℃超聲萃取30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液0.3 mL于10 mL容量瓶，用體積分數70%的乙醇定容，測定275 nm處吸光值，代入線性回歸方程，計算異黃酮總含量。

1.2.2 異黃酮類化合物含量測定 液相色譜為Agilent 1000 LC(Santa Clara, CA, USA)，VWD檢測器，反相 C18 柱(顆粒粒徑為 5 μm， 4.6 mm×250 mm，美國)，柱溫 30 ℃。流動相：A 相為體積分數0.1%的乙酸水，B 相為色譜甲醇，流速 0.6 mL/min；檢測波長275 nm，進樣量 20.0 μL。洗脫程序為：0～5 min，40% B；10～ 20 min，70% B；35 min，85% B； 40 min，100% B。分別制備4個標準品在質量濃度為0～0.5 mg/mL的標準曲線。

試驗數據以3個重復的“平均值±標準差”表示，用SPSS 24.0進行成對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 刈割所得地上部分質量

從表1可見，紅三葉地上部分質量均隨刈割次數增加而減少，差異顯著(P<0.05)，主要原因為紅三葉具有直立生長的特性。

表1 紅三葉刈割所得地上部分質量Table 1 Mass of aboveground part of red clover obtained by mowing g

2.2 刈割對異黃酮總含量的影響

從表2可知，‘海發’和‘炫麗’紅三葉在每次刈割后異黃酮總含量均增加。 ‘炫麗’葉片的異黃酮總含量均高于‘海發’，但刈割處理后，‘海發’葉片的異黃酮總含量增幅為50.6%，高于‘炫麗’28.0%的增幅。刈割后6 h內莖稈異黃酮總含量均有所增加，差異不顯著(P>0.05)。此外，兩品種莖稈中異黃酮總含量均低于葉片。

表2 紅三葉異黃酮總含量Table 2 Isoflavone contents of red clover %

2.3 刈割對葉片中異黃酮類化合物含量的影響

從表3可知，刈割前‘海發’葉片中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量均高于‘炫麗’，刈割處理后兩種化合物含量在‘海發’葉片中均降低，降幅為20.2%和15.6%，差異不顯著。而在‘炫麗’葉片中均顯著增加(P<0.05)，增幅為46.8%和 35.3%。刈割后兩種化合物在‘海發’葉片中的含量低于在‘炫麗’中的含量。大豆苷元和染料木素含量在‘炫麗’葉片中略有下降，在‘海發’葉片中增加，但差異均不顯著。

表3 葉片中異黃酮類化合物含量Table 3 Contents of three isoflavones in red clover leaves mg/g

4種化合物在葉片中含量為鷹嘴豆素A > 芒柄花素 > 大豆苷元 > 染料木素，刈割對其含量大小排序沒有影響。其中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量最多，染料木素在4種化合物中含量 最低。

2.4 刈割對莖稈中異黃酮類化合物含量的影響

由表4可知，刈割后‘炫麗’莖稈中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量均增加，在第 2 次和第 3 次刈割后增幅均高于70%，其中鷹嘴豆素A含量在第 2 次刈割后顯著增加(P<0.05),芒柄花素含量在第 1 次和第 2 次刈割后均顯著增加(P< 0.05)。鷹嘴豆素A含量在‘海發’莖稈中隨刈割次數增加而增加，差異不顯著，芒柄花素含量在第 1 次刈割后增加，在第 2 次刈割后略有下降，差異不顯著。此外，兩品種莖稈中大豆苷元含量均高于葉片，‘炫麗’莖稈中的含量隨刈割次數增加而增加，在第 3 次刈割時顯著增加(P<0.05)?！０l’莖稈中大豆苷元含量略高于葉片，呈先增加后降低的趨勢，在第 1 次刈割后顯著增加(P< 0.05)，在第 2 次刈割后降低。除 ‘海發’第 2 次刈割樣品，染料木素在莖稈中的含量均高于對應的葉片處理。莖稈中該化合物含量在‘炫麗’刈割后先顯著減少后增加，在‘海發’中表現為不斷降低,差異不顯著。

表4 紅三葉莖稈中異黃酮類化合物含量Table 4 Contents of isoflavones in red clover stems mg/g

3 討論與結論

植物與環境長期相互作用和生存競爭的過程中，形成一套完整的防御體系適應環境脅迫，降低不利環境帶來的損害。一方面通過改變形態結構作為機械/物理防御策略，另一方面則利用生理生化響應作為化學防御策略[23]。

本試驗比較了紅三葉在6 h內2次刈割后異黃酮總含量及4種異黃酮類化合物含量的變化，結果表明，6 h內刈割損傷使紅三葉植物體內異黃酮總含量大幅增加。可能原因在于刈割會使植物體產生機械損傷，導致植物體內活性氧自由基激增，而異黃酮具有抗氧化功能[16-17,24-25]，因此在植物體受到刈割后被大量合成以清除植物體內的過量自由基，最大限度降低機體的損傷，維持植物的正常生命活動。有研究表明，機械刺激會提高異黃酮合成關鍵酶苯丙氨酸解氨酶活性，通過提高次生代謝相關酶活性從而加強次生代謝產物的合成和積累，激活植物體內次生代謝防御系統[26]。此外，植物的應激反應模型表明，植物在正常狀態下初生代謝和次生代謝處在一個動態平衡過程中，刈割作為一種較強的脅迫刺激會使該平衡產生波動或出現混沌狀態，導致次生代謝的增強，即通過產生相應的次生代謝產物緩解和適應逆境脅迫環境[27-28]。

葉片由大量薄壁細胞組成，而薄壁細胞是植物積累次生代謝產物的主要部位[8]。因此，兩品種紅三葉均表現為葉片異黃酮總含量高于莖稈，鷹嘴豆素A和芒柄花素在葉片中的含量高于莖稈，但大豆苷元和染料木素在葉片中的含量低于莖稈。此外，‘炫麗’的異黃酮總含量高于‘海發’，但‘海發’在刈割后其增幅高于‘炫麗’，可能原因在于不同品種響應刈割刺激敏感度不同。不同的異黃酮類化合物在刈割6 h內表現出不同的變化趨勢。‘炫麗’葉片中鷹嘴豆素A和芒柄花素含量在刈割處理后增加，‘炫麗’葉片中大豆苷元含量在刈割后略有下降，在‘海發’葉片和‘炫麗’莖稈中均增加，在‘海發’莖稈第 1 次刈割后增加，第 2 次刈割后下降。染料木素含量僅在‘海發’葉片刈割處理后增加，在‘炫麗’葉片及莖稈中均降低。由于大豆苷元和染料木素含量較低，因此對異黃酮總含量變化影響較小。

雖然不同品種和部位異黃酮類化合物含量變化有所差別，但是刈割后整體上不同品種和部位異黃酮總含量均增加，充分說明異黃酮是該植物受到機械損傷的主要抗逆和防御物質之一。本研究結果將為紅三葉刈割后修復再生生產提供理論依據，為牧草生產科學管理與規劃提供參考。