金錢(qián)草莖、葉中槲皮素、山柰素及其重金屬含量測(cè)定對(duì)比研究

韓麗麗，孫俊英，李 飛

(1 濰坊市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濰坊 261100；2 東營(yíng)市食品藥品檢驗(yàn)中心，東營(yíng) 207091；3 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261061)

金錢(qián)草為報(bào)春花科植物過(guò)路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草，別名大金錢(qián)草、對(duì)座草、路邊黃、遍地黃[1]；味甘、咸，微寒；歸肝、膽、腎、膀胱經(jīng)；具有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫之效；用于濕熱黃疸、膽脹脅痛、石淋、熱淋、小便澀痛等[2]。金錢(qián)草主要含有酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、苷類(lèi)、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及氨基酸等化學(xué)成分，其中酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)是其主要活性成分[3-5]，《中國(guó)藥典》2020年版一部對(duì)槲皮素和山柰素含量進(jìn)行了控制。筆者在檢驗(yàn)工作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，同一批次金錢(qián)草含量測(cè)定結(jié)果不一致，究其原因是所抽樣品中莖葉比例不一致。另外，目前對(duì)金錢(qián)草重金屬含量測(cè)定尚無(wú)報(bào)道。本研究將金錢(qián)草莖、葉分開(kāi)，分別測(cè)定莖、葉中槲皮素、山柰素以及鉛、鎘、銅、汞、砷5種重金屬的含量，為金錢(qián)草質(zhì)量控制以及安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；MARS 6 CLASSIC微波消解儀(美國(guó)培安公司)；Agilent Technology 7900 ICP-MS(美國(guó)安捷倫公司)；XSE-204電子天平(瑞士梅特勒公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；102電熱恒溫干燥箱(濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 試藥

山柰素對(duì)照品(批號(hào)110861-201611，含量93.8%)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)100081-201610，含量99.1%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)177011-1，含量1000 μg/ml)、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)163080-3，含量1000 μg/ml)、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)165017-1，含量1000 μg/ml)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)16C043-1，含量1000 μg/ml)、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)16C060-1，含量1000 μg/ml)、金標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)171042-2，含量1000 μg/ml)，均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；內(nèi)標(biāo)(混合)標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)5190-8593-1，含量100 μg/ml)，購(gòu)自安捷倫科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水；甲醇、硝酸為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

經(jīng)鑒定均為金錢(qián)草(即報(bào)春花科植物過(guò)路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草)，信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 槲皮素、山柰素含量測(cè)定[2]

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μl，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備

取槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇制成每1 ml各含槲皮素4 μg、山柰素20 μg的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備

取各樣品全草、莖、葉粉碎，過(guò)三號(hào)篩，分別取約1.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 ml，精密加入鹽酸5 ml，置90 ℃水浴中加熱水解1 h，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，即得。色譜圖見(jiàn)圖1、測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 金錢(qián)草HPLC色譜圖

表2 金錢(qián)草全草、莖、葉中槲皮素、山柰素含量測(cè)定結(jié)果

2.2 重金屬含量測(cè)定

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、空白溶液的制備

參考《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2321。

2.2.2供試品溶液的制備

取槲皮素、山柰素含量測(cè)定項(xiàng)下的金錢(qián)草全草、莖、葉粉末，于60 ℃干燥2 h，取約0.25 g，精密稱(chēng)定；置微波消解罐中，加硝酸10 ml，過(guò)氧化氫3 ml，密閉、消解；按表3消解程序消解2次，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷；將消解液轉(zhuǎn)入50 ml量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/ml)200 μl，用水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得。

表3 消解程序

2.2.3測(cè)定方法[2]

測(cè)定時(shí)選取的同位素為63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb，其中63Cu、75As以72Ge作為內(nèi)標(biāo)，114Cd以115In 作為內(nèi)標(biāo)，202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)；以測(cè)量值(3次讀數(shù)的平均值)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定供試品溶液，取3次讀數(shù)的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得相應(yīng)的濃度。在同樣的分析條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)。ICP-MS工作參數(shù)見(jiàn)表4、標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2、測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 ICP-MS工作參數(shù)

表5 金錢(qián)草重金屬含量測(cè)定結(jié)果

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

筆者在檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，不同使用單位同一來(lái)源(同一生產(chǎn)廠家同一批次)的金錢(qián)草，槲皮素、山柰素含量測(cè)定結(jié)果差異較大，出現(xiàn)了合格與不合格兩種結(jié)論。經(jīng)過(guò)對(duì)比樣品發(fā)現(xiàn)，二者莖葉比例不同，其中葉子少者含量低，導(dǎo)致不合格。本研究將金錢(qián)草莖、葉分開(kāi)，分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，莖、葉中槲皮素、山柰素含量差別較大，葉的含量較高，為莖的3～8倍。提示在飲片生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)充分混合均勻，否則會(huì)導(dǎo)致同一生產(chǎn)廠家同一批次樣品，在不同使用單位，按照同一標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，出現(xiàn)不同結(jié)論；在抽樣和檢測(cè)過(guò)程中，取樣亦應(yīng)嚴(yán)格按照四分法取樣，保證取樣的均一性，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。

《中國(guó)藥典》2020年版一部收載的金錢(qián)草沒(méi)有重金屬測(cè)定項(xiàng)目，為考察其重金屬含量情況，本研究隨機(jī)對(duì)4批金錢(qián)草的全草、莖、葉進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，葉中5種重金屬元素鉛、鎘、銅、汞、砷的含量均高于莖。說(shuō)明葉的重金屬富集較多，如果樣品中莖葉比例不一致，亦會(huì)出現(xiàn)不同測(cè)定結(jié)果，為金錢(qián)草安全評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

金錢(qián)草同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重，偽品較多，摻偽率高達(dá)68.6%，而且多已破碎，真假難辨[6-10]。鑒于金錢(qián)草莖、葉中槲皮素、山柰素以及鉛、鎘、銅、汞、砷的含量差別較大，可以考慮將莖葉比例訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以提高金錢(qián)草的質(zhì)量控制，確保用藥安全。