柑橘黃龍病菌在柑橘病樹不同部位中的定量分布情況研究

馮賢巧

（陽江市植保植檢和種子土肥環保管理站 廣東陽江529500）

柑橘黃龍病是全球柑橘產業中威脅最大的柑橘病害[1]。我國是柑橘主產國，但有9個柑橘主產省受到該病的危害，其中，廣東省有24萬hm2橘園，目前有1/3以上感染該病，年損失達上百億元[2-3]。

柑橘黃龍病的病原物為韌皮部桿菌屬細菌，柑橘植株被侵染后，植株生長緩慢，發病葉片常表現為均勻或斑駁黃化，而發病果實變小或畸形，常出現“紅鼻子果”或果皮青綠等癥狀，果實品質大大降低。柑橘感病后在3～5年內死亡或喪失結果能力[4]。

不同的柑橘品種對黃龍病菌的感病性不同，本研究利用實時熒光定量PCR，對廣東省陽春市馬水鎮4個柑橘品種多個部位上采集的樣品進行檢測，定量分析了柑橘黃龍病菌在柑橘病樹中的分布情況，以期為黃龍病的檢測和綜合防控提供參考依據。

1 材料方法

1.1 樣品采集

2019年9～12 月在馬水鎮采集病樣。選擇已感染柑橘黃龍病菌的4種柑橘品種馬水橘、砂糖橘、貢柑和蜜柚進行采樣。每個品種隨機選擇3棵獨立的植株進行采樣，分別收集新葉、成熟葉及果實的果皮、橘絡、囊壁、中心柱等部位。

1.2 植物DNA的提取及柑橘黃龍病菌的檢測

用去離子水將柑橘組織沖洗干凈，稱取200 mg柑橘組織。采用植物DNA提取試劑盒提取植物總DNA。提取的DNA樣品取1μL用核酸定量儀測定濃度，其余樣品保存于-20℃條件下。檢測采用實時熒光定量PCR方法，引物與探針參照Li等[5]設計的引物HL-Bas/HLBr和探針HLBr，每個樣品重復檢測3次，取平均值。

1.3 柑橘黃龍病菌靶標基因標準曲線的建立

參照李智鵬等人的方法[6]，將含有柑橘黃龍病菌靶標基因的陽性質粒10倍液稀釋成9個濃度梯度，使用實時熒光定量儀器進行PCR檢測，每個濃度梯度做3個技術性重復，并獲得標準曲線。根據標準曲線獲得的線性回歸方程為：

y=-3.369 lg（x）+15.738， 式中，y為Ct值，x為DNA濃度，單位為ng/mL。

2 結果與分析

2.1 柑橘黃龍病菌在不同柑橘品種不同葉片部位中的含量

4個柑橘品種分別隨機選擇3棵有黃龍病發病癥狀的病樹采集樣品，樣品使用實時熒光定量PCR方法進行檢測，這些樣品中的黃龍病菌含量在234.02～12 868 503.64拷貝/每克植物組織之間，平均含量約為1 641 452.32拷貝/每克植物組織（表1）。

每個柑橘樹分別收集新葉葉脈、新葉葉肉、成熟葉葉脈和成熟葉葉肉樣品，4個品種收集的4類樣品中的柑橘黃龍病菌靶標基因平均含量順序為成熟葉葉脈＞成熟葉葉肉＞新葉葉脈＞新葉葉肉（表1）。

成熟葉葉脈樣品和成熟葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標基因含量均顯著高于新葉葉脈樣品和新葉葉肉樣品，但成熟葉葉脈樣品和成熟葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標含量差異不顯著，新葉葉脈樣品和新葉葉肉樣品中的黃龍病菌靶標基因含量差異也不顯著。

表1 柑橘黃龍病菌在不同柑橘品種不同葉片部位中的靶標基因含量

2.2 不同柑橘品種果實不同部位樣品中的靶標基因含量

4個柑橘品種的果實分別采集囊壁、橘絡、果實中柱、果皮和種皮5個不同部位的樣品，囊壁樣品中的黃龍病菌靶標基因平均含量約為147 735.98拷貝/每克植物組織，橘絡樣品中的黃龍病菌靶標基因平均含量約為92 038.65拷貝/每克植物組織，果實中柱樣品中的黃龍病菌靶標基因平均含量約為35 599.74拷貝/每克植物組織，果皮樣品中的黃龍病菌靶標基因平均含量約為4 316.67拷貝/每克植物組織，種皮樣品中的黃龍病菌靶標基因平均含量約為91 525.49拷貝/每克植物組織（表2）。

從4個品種收集的5類樣品中的柑橘黃龍病菌靶標基因平均含量順序為囊壁樣品＞橘絡樣品＞種皮樣品＞果實中柱樣品＞果皮樣品，囊壁、橘絡樣品中的柑橘黃龍病菌靶標基因含量與果皮樣品中的靶標基因含量之間有顯著差異，而其他樣品間無顯著差異。

3 討論

本研究采用實時熒光定量PCR對廣東省陽春市馬水鎮4個柑橘品種9個部位中采集的樣品進行檢測，結果表明，柑橘黃龍病菌廣泛分布于柑橘的多個部位，但在不同的柑橘個體及不同部位樣品中，黃龍病菌的分布很不均勻。

表2 不同柑橘品種果實不同部位樣品中的靶標基因含量

本研究對馬水鎮4個柑橘品種葉片樣品的分析表明，成熟葉的葉脈樣品和葉肉樣品中的黃龍病菌靶標基因含量均顯著高于新葉的葉脈和葉肉樣品，與前人的研究一致[7-9]。但是，肖翠等人的研究表明，病樹成熟葉片中的黃龍病菌含量顯著高于新葉葉片中的黃龍病菌含量[10]，本研究數據表明，病樹成熟葉片中的黃龍病菌含量高于新葉葉片中的黃龍病菌含量，但并不顯著，可能與實驗的采樣方法有關。

褚麗萍等人研究表明，砂糖橘果實中的柑橘黃龍病菌靶標基因平均含量順序為橘絡樣品＞果皮樣品＞中柱樣品＞囊壁樣品[11]，而本研究在馬水鎮4個柑橘品種果實上采集的5類樣品中的柑橘黃龍病菌靶標基因平均含量順序為囊壁樣品＞橘絡樣品＞種皮樣品＞果實中柱樣品＞果皮樣品，存在部分不一致之處，可能與品種及采樣方法有關。