‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生研究

劉淑芳

（遼寧農業職業技術學院 營口115009）

葡萄（Vitis vinifera L.）遺傳背景比較復雜，育種周期較長，常規的育種方法在葡萄品種改良上受到明顯的限制。隨著生物技術的發展，將目的基因轉入葡萄植株體內，可改良某些性狀，從而提高育種效率，這為改良葡萄品種開辟了一條新的路徑[1]，建立一個高效穩定的葉盤再生受體系統在農桿菌介導的遺傳轉化法中顯得非常重要。為此，我們探討了不同生長調節劑組合、培養基和暗培養對‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生的影響，以期為建立一個高效、穩定的再生系統和基因轉化體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以葡萄品種‘遼峰’為試材。試驗在遼寧農業職業技術學院農學園藝系組培實訓室進行，試驗時間為2018年3月至2020年12月。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同生長調節劑組合的篩選 按L16（44）正交試驗設計（表1、表2），以MS為基本培養基，附加蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L及水解酪蛋白（CH）0.25 g/L，pH 5.8。從苗齡35 d左右的‘遼峰’葡萄組培苗上剪取頂部平展幼嫩的葉片，橫剪為0.5～1.0 cm2大小葉塊，以葉背接觸培養基。每個處理接種20個葉塊，重復3次，接種后培養皿用‘Parafilm’密封。

1.2.2 基本培養基對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響分別以1/2 MS、MS、WPM、NN69為基本培養基，附加篩選出的最佳生長調節劑組合，按前述方法接種‘遼峰’葡萄葉片。

1.2.3 暗培養對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響 將葉片接種在篩選出的最佳生長調節劑組合和最佳基本培養基上，分別進行0、7 d、14 d和21 d的暗培養處理后，置于光下常規培養。

1.2.4 培養條件 培養溫度（25±2）℃，光照度2 400～3 000 lx，光照周期16 h/8 h。

1.2.5 試驗結果觀察與數據統計分析 在培養過程中，定期觀察葉片變化和不定芽發生情況。培養至50 d時，統計不定芽再生率和平均每葉芽數。

試驗數據采用Excel和SPSS數據統計分析軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同生長調節劑組合對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

‘遼峰’葉片接種在BA-Auxin組合上的試驗結果見表1，培養7 d后就可觀察到3#、4#、6#～8#、14#～16#處理上出現少量白色愈傷組織，隨著培養時間的延長，愈傷組織逐漸增多，培養21d后，7#、8#、14#處理上的愈傷組織呈黃白色，個別葉塊傷口處出現黃綠色的芽點，15#、16#處理上的愈傷組織轉為綠白色、半透明緊密狀，其他處理上的愈傷組織開始變褐死亡。 此后，僅有3#、4#、7#、8#、14#處理上有極少量不定芽伸長形成不定梢，1#～14#處理間不定芽再生率差異不顯著。

表1 ‘遼峰’離體葉片不定芽再生試驗方案L16（44）與結果統計（BA濃度）

‘遼峰’葉片接種在TDZ-Auxin組合上時（表2），愈傷組織和不定芽的發生情況普遍優于BA-Auxin組合上，且發生量也明顯增多。培養20多天后，17#、21#、22#、25#、27#～29#、32#處理上的愈傷組織或葉片相繼褐化死亡。其余處理培養21 d后葉片傷口或愈傷組織上開始出現密集的綠色小芽點，接種20～35 d為不定芽發生高峰期，隨后芽點逐漸增大發育為不定芽，50 d后不定芽數不再增加，只是原有的不定芽伸長為不定梢，20#處理上不定芽再生率高達65.68%，極顯著高于其他處理。

表2 ‘遼峰’離體葉片不定芽再生試驗方案L18（44）與結果統計（TDZ濃度）

2.2 基本培養基對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

1/2MS、MS、WPM、NN69 4種基本培養基附加篩選出的最佳生長調節劑組合NAA 1.2 mg/L+TDZ 3.0 mg/L對葉片不定芽再生影響結果見表3。1/2 MS作為基本培養基效果最好，不僅愈傷組織極少，而且不定芽再生率和平均每葉再生芽數都較高，與其他處理差異極顯著。MS培養基上愈傷組織也較少，但不定芽再生率低于1/2 MS，與賈曉平[2]的研究一致，這可能是由于MS培養基無機鹽含量較高，促進了愈傷組織的形成。‘遼峰’葉片在WPM上不定芽再生能力較差，只產生少數幾個不定芽，而在NN69上無不定芽發生。

表3 基本培養基對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

2.3 暗培養對‘遼峰’葉片不定芽誘導的影響

‘遼峰’葉塊接種于最佳培養基1/2MS+NAA 1.2 mg/L+TDZ3.0 mg/L上，分別進行0、7 d、14 d、21 d的暗培養，然后再轉入光下常規培養。結果表明（表4），暗培養可促進‘遼峰’葡萄葉片不定芽的再生，各處理間存在極顯著差異。暗培養14 d的不定芽再生率最高，達87.10%，隨著暗培養時間加長，不定芽再生率呈下降趨勢。試驗發現，暗培養時間對平均每葉塊再生芽數的影響差異不顯著。

表4 暗培養對‘遼峰’葉片不定芽再生的影響

3 結論與討論

在植物組織培養中，培養基中添加一定濃度的生長調節劑可以調整外植體的激素水平，因此尋求適宜的生長調節劑組合尤其重要。本研究結果表明，不同生長調節劑組合、基本培養基和暗培養對‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生均有顯著作用。將‘遼峰’葉片接種在1/2 MS+NAA 1.2 mg/L+TDZ 3.0 mg/L上，先暗培養14 d，后轉入光下培養，對‘遼峰’葉片不定芽再生效果最好，不定芽再生率高達87.10%，且不定芽生長健壯。

陳力耕等[3]以‘玫瑰香’葡萄莖段為外植體建立起高頻器官再生體系，并進行了基因的遺傳轉化，獲得了轉基因植株；陶建敏等[4]研究了不同激素組合對‘美人指’葡萄葉片、葉柄和莖段不定芽發生的影響，結果表明，莖段不定芽再生頻率最高，達到75%。目前，葡萄再生體系的報道較多，但只有少數品種再生率較高[5-6]，且未見‘遼峰’葡萄葉片不定芽再生的報道。由于不同基因型葉片不定芽誘導率差異較大，不同外植體類型再生效果也不同，同一葉片不同部位誘導率也各異，因此，在進行葡萄再生體系的研究中，除了研究基本培養基、生長調節劑組合、添加物和培養條件外，也要進行葡萄器官發生機理研究，以便從根本上解決葡萄葉片再生較難、再生率低等問題。