棗莊地區豌豆根瘤菌遺傳多樣性分析

黃宇寧 葛維德 張俊杰 楊 濤 劉 榮 尚益民李 冠 季一山 王晨瑜 李孟偉 嚴 昕 宗緒曉

（1.中國農業科學院作物科學研究所 北京100081；2.遼寧省農業科學院作物研究所 沈陽110161；3.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院 河南鄭州450002）

根瘤菌（Rhizobium）是一類與豆科植物共生的革蘭氏染色陰性細菌[1]，能夠誘發豆科植物根或莖上皮層細胞增生形成根瘤，還可以通過結瘤固定空氣中的無機氮轉化為宿主植物生長所需的有機氮[2]。氮素作為植物生長發育必需的元素之一[3]，在現代農業生產中通過施工業氮肥來提高作物產量[4]。而長時間不恰當地使用工業氮肥會造成土壤營養流失甚至嚴重破壞農業生態環境，因此，生物固氮則成為植物補充氮素的重要途徑。在生物固氮體系中60%以上的生物固氮量是通過根瘤菌—豆科植物共生體系完成的，對農業生產和生態環境保護具有非常重要的作用[5-6]。國內對根瘤菌的很多研究技術都是鑒定和分類菌株，楊成運等[7]對我國亞熱帶地區豌豆根瘤菌的研究發現，供試菌株的分類具有明顯的地域特征。李正等[8]對甘肅酒泉等地區的6株豌豆根瘤菌的研究發現，其具有很高的遺傳多樣性。Jiao等[9]在安徽和江西地區的豌豆根瘤中分離得到Rhizobium anhuiense。Li等[10]在山東半島海岸線上研究發現，Rhizobium anhuiense是海邊香豌豆的主要根瘤菌種群。

豌豆（Pisum sativum L.）是草本攀援性豆科植物，豌豆作為世界四大食用豆之一[11]，富含優質蛋白及人體所需的微量元素，在我國廣泛種植，是農業可持續發展中具有重要地位的糧飼作物[12]。豌豆的生物固氮作用可以減少氮肥的使用、減少CO2的排放和提高土壤肥力，還可以與其他非豆科作物進行輪作或套作來調整種植結構[13]，使非豆科作物更好地吸收和利用土壤中氮素，從而實現高產高效及減少連作所導致病蟲害的發生[14-15]。因此，研究豌豆根瘤菌的遺傳多樣性篩選并接種合適的根瘤菌對提高豌豆產量具有重要意義。在本試驗中，采集棗莊市山亭區豌豆種植基地土壤，通過土壤捕捉試驗獲得豌豆根瘤[16]，對經過分離純化的豌豆根瘤菌采用IGS-PCR RFLP分析、16SrRNA序列分析、持家基因和共生基因的系統發育分析等方法進行分子鑒定。通過研究了解該地區豌豆根瘤菌遺傳多樣性及分類學地位，為今后豌豆根瘤菌優良菌株的選取提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源 研究所用土壤采集于棗莊市山亭區豌豆種植基地，采集時間為2018年5月，豌豆種子由中國農業科學院作物科學研究所國家作物種質庫提供。

1.1.2 盆栽捕捉豌豆根瘤菌 將豌豆種子用無菌水清洗后用95%乙醇消毒30 s，倒掉95%乙醇后用0.2%的升汞溶液消毒5 min，消毒徹底的豌豆種子排放在水瓊脂培養基平板上，置于28℃培養箱中暗培養至種子完全萌發。將采集的土壤與加入植物低氮營養液且滅菌后的蛭石以1∶2的比例混合攪拌均勻，移入發芽種子后在人工氣候箱中培養45 d（光照時間為16 h/d,晝、夜溫度分別控制在28℃、20℃）。

1.1.3 根瘤菌的分離、純化與保藏 采集的粉紅色有效根瘤用0.2%的升汞溶液表面消毒后在YMA平板上用劃線法進行分離純化[17]，得到的單菌落接種到YMA斜面培養基，進行臨時保存；同時將單菌落用TY液體培養基培養至對數生長期后與50%的甘油以1∶1（體積比）混合均勻后長期保存在-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑和儀器

5×TBE、80%生理鹽水、95%乙醇、0.2%升汞溶液、無菌水、蒸餾水等。光照培養箱、28℃恒溫培養箱、PCR儀、電泳儀、恒溫水浴鍋、滅菌鍋、超凈工作臺、高速離心機、pH計、微波爐及冰箱等。

1.3 培養基和根瘤菌DNA提取

水瓊脂培養基：8 g瓊脂粉中加入1 000 mL去離子水。

YMA培養基：10 g甘露醇，3 g酵母粉，0.25 g KH2PO4，0.25 g K2HPO4，0.1 g NaCl，0.1 g無水MgSO4加1 000 mL去離子水，調pH至6.8～7.2，最后加入15～18 g瓊脂粉。

TY培養基：3 g酵母粉，5 g胰蛋白胨，0.7 g CaCl·22H2O，加入1 000 mL去離子水，調pH至6.8～7.2。

DNA的提取：首先將單菌落在TY培養基中震蕩培養至對數生長期，然后使用生工生物工程（上海）股份有限公司的細菌DNA提取試劑盒（B518255-0050）進行DNA提取，得到的DNA樣品檢測合格后置于-20℃冰箱中待用。

1.4 16S-23S rRNA的PCR-RFLP檢測分析

IGS（Intergenic Spacer）PCR擴增的正反向引物為FGPS1490和FGPL132′，引物正反序列見表1[18]，PCR擴增反應及反應運行程序參考文獻[18]中方法。將獲得的PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進行酶切反應。選取的3種限制性內切酶分別為HaeIII、HhaI和MspI。酶切反應為10μL體系，其中包括16S-23S rRNA產物5μL、限制性內切酶0.5μL、10×Buffer 1μL和ddH2O 3.5μL， 在37℃恒溫培養箱酶切8～10 h。酶切完成后經2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將凝膠成像系統顯示的酶切條帶大小進行分型處理。

表1 試驗用的PCR引物

1.5 16S rRNA基因的序列測定及系統發育分析

選取IGS酶切不同類型的代表菌株進行16S rRNA的PCR擴增，正反向引物為P1和P6，引物正反序列見表1[18]，PCR擴增反應及反應運行程序參考文獻[18]中方法。將合格的PCR產物送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。利用DNAMAN軟件進行序列的拼接、GenBank數據庫和MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W程序計算序列之間的遺傳距離，并構建系統發育樹。

1.6 持家基因和共生基因PCR擴增及系統發育分析

分別用持家基因（atpD、recA、glnII）和共生基因（nodC）對代表菌株進行的PCR擴增，正反向引物分別為atpD 225F/782R、recA 41F/640R、glnII 12F/689R和nodC for540/rev1160，引物正反序列見表1[18]，PCR擴增反應及反應運行程序參考文獻[18]中方法。代表菌株的PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序，數據處理同“1.5”。

2 結果與分析

2.1 根瘤菌分離、純化以及保藏

一共從根瘤中分離獲得55株菌，菌株在28℃的培養箱中培養3～5 d，菌落直徑達到3～5 mm，這些單菌落呈圓形，不透明，表面光滑濕潤、有凸起，獲得的菌株臨時保藏于YMA培養基斜面。

2.2 16S-23S rRNA的PCR-RFLP檢測分析結果

經過3種限制性內切酶 （HaeIII、HhaI和MspI）酶切及酶切圖譜整合、歸類，最終把55株豌豆根瘤菌分為3種IGS類型（表2）。類型1包含12株根瘤菌，占總菌數的21.8%；類型2含22株，占總數的40.0%；類型3含21株，占總數的38.2%。類型2和類型3為主要圖譜類型，2種類型的總和占總菌數比例達78.2%。

2.3 16S rRNA基因序列及系統發育分析結果

根據IGS的酶切圖譜分型結果，從3種酶切類型中選取9個代表菌株，其中類型1有3株，分別是SD1、SD2-1、SD3-13，類型2有2株，分別是SD1-11和SD2-2，類型3有4株，分別是SD1-14、SD2-10、SD3-14、SD3-15。將這9個代表菌株進行16SrRNA基因的PCR擴增，檢測合格的擴增產物送到公司測序，得到的基因序列數據處理后經過NCBI序列比對，選取具有較高序列相似性的參考序列和部分已知根瘤菌屬種群的序列，用Mega 7.0軟件進行分析并基于NJ（Neighbor-Joining）法構建系統發育樹（圖1）。9個代表菌株與根瘤菌屬的代表菌株聚成1個進化分支，由此判定棗莊市山亭區的豌豆根瘤菌屬于根瘤菌屬。對于這個進化分支，9個代表菌株之間序列相似性為100%， 與Rhizobium acidisoli FH13T、Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T等4株已知根瘤菌代表菌株序列相似性均為100%。參試9株豌豆根瘤菌的序列與剩余的已知根瘤菌屬種群的序列相似性均大于98.6%，且與外源群體的模式菌株Bradyrhizobium japonicum USDA 6T（大豆慢生根瘤菌）的相似性小于88.0%，最終，所有豌豆根瘤菌被鑒定屬于根瘤菌屬（Rhizobium）。

2.4 持家基因atpD、rec A、glnII多位點序列分析結果

將9個代表菌株進行atpD、recA、glnII持家基因的PCR擴增，得到的測序結果完成序列比對后把持家基因序列合并，利用軟件MEGA7.0分析得到系統發育樹（圖2）。參試的9株豌豆根瘤菌代表菌株被分做了2個類群，第1個類群中7株代表根瘤菌菌株與已知序列的代表菌株Rhizobium anhuiense CCBAU 23252T序列相似性最高，為99.0%～99.9%，7株代表菌株與剩余的根瘤菌屬模式菌株序列相似性均≤95.7%，所以，該分支中的豌豆根瘤菌可被鑒定為Rhizobium anhuiense。第2個類群中2株代表根瘤菌菌株與已知序列的代表菌株Rhizobium sophorae CCBAU 03386T序列相似性最高，為≥99.2%，而與剩余的根瘤菌屬模式菌株序列相似性均≤96.0%，所以該分支中的豌豆根瘤菌可被鑒定為Rhizobium sophorae。

2.5 結瘤基因nod C系統發育分析結果

供試菌的結瘤基因nodC通過系統發育分析得到3個基因型（圖3），基因型1中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium multihospitium CCBAU 83401、Rhizobium leguminosarum bv.viciae SWD43-2和Rhizobium laguerreae mlsc02高達100%，基因型2中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium l aguerreae pepv11為99.7%，基因型3中的豌豆根瘤菌代表菌株nodC基因的序列相似性與Rhizobium leguminosarum A1為100%。系統發育分析結果表明，供試菌的結瘤基因具有一定的多樣性。

表2 參試豌豆根瘤菌菌株的IGS PCR－RFLP結果

3 結論與討論

本研究從棗莊市山亭區豌豆種植基地一共分離獲得豌豆根瘤菌55株，并通過IGSPCR-RFLP、16S rRNA基因、持家基因和共生基因的測序及系統發育分析等對其進行分子鑒定和遺傳多樣性的分析。首先，通過IGSPCR-RFLP分析將獲得的豌豆根瘤菌菌分為3種酶切類型；其次，通過16SrRNA基因測序及系統發育分析確定供試菌屬于根瘤菌屬（Rhizobium）；最后通過持家基因的 （atpD-recA-glnII）MLSA系統發育分析將供試菌鑒定屬于2個已知種群，分別是R.anhuiense和R.sophorae。而在這2個種群中R.anhuiense數量明顯高于R.sophorae，由此判定R.anhuiense為主導類群，而早在2015年R.anhuiense在安徽和江西地區的豌豆和蠶豆根瘤中首次被發現并報道[9]，又在2016年的研究中確定R.anhuiense是山東半島海岸線上海邊香豌豆主要根瘤菌種群[10]，說明山東地區土壤中存在R.anhuiense且能與豆科植物形成根瘤。Jiao等在2015年山西地區的苦參根瘤中首次分離出R.sophorae[9]，Chen等又在四川省的蠶豆根瘤中分離出R.sophorae[19]，本研究中也發現了該種群的存在，表明該種群具有廣泛的地理分布和適應環境的能力。本研究所獲得的菌株有助于因地制宜地篩選出適應性強的優質豌豆根瘤菌菌株，為棗莊地區豌豆種植基地根瘤菌菌劑的研發和使用奠定基礎。在結瘤基因（nodC）系統發育分析中，供試菌與R.multihospitium、R.leguminosarum及R.laguerreae具有相近的結瘤基因，表明了豌豆根瘤菌的結瘤基因具有較好的多樣性。

圖1 參試菌株的16S rRNA基因的系統發育樹

圖2 參試菌株（atpD-rec A-glnII）MLSA系統發育樹

圖3 參試菌株nodC共生基因的系統發育樹