冠心通絡方通過PI3K/Akt通路延緩氧化應激對糖尿病大鼠 主動脈的影響*

姚燦坤，牟雷，張天奉，唐新征

廣州中醫藥大學深圳醫院 廣東深圳 518034

近10年來，2型糖尿病引發的以動脈粥樣硬化為代表的心血管并發癥的發病率在全球范圍內不斷上升，成為2型糖尿病患者最常見的死因，嚴重危害了人類健康[1]。流行病學研究發現，超過50%的糖尿病患者最終將死于糖尿病的大血管病變[2]。

糖尿病是心血管系統疾病的獨立危險因素，高血糖狀態下可刺激氧化應激反應與炎癥反應，加快動脈粥樣硬化的發生、發展[3]，從而導致糖尿病血管病變，糖尿病血管病變是導致糖尿病致死、致殘的主要原因。雖然糖尿病血管病變的發病機制目前還未清楚，但是可以明確的是動脈粥樣硬化是糖尿病合并血管病變的病理基礎。中醫藥在糖尿病及動脈粥樣硬化預防及治療上具有副作用少、療效確切等優勢[4-5]，其研究成果已被2017版《中國2型糖尿病防治指南》采用并推薦防治糖尿病及其并發癥。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B （PI3K/Akt）信號通路是膜受體信號向細胞內轉導的重要途徑，通過血管內皮細胞遷移、血管形成、能量代謝等多種機制調控心血管功能，與氧化應激、炎癥反應關系密切[6-7]。

冠心通絡方為廣州中醫藥大學深圳醫院心血管病科的協定處方，臨床應用效果良好，無不良反應，是以補陽還五湯為基礎方加減而來，動物實驗及臨床研究均表明具有活血通絡的補陽還五湯可以通過降糖、調脂、減輕炎癥、改善氧化應激等對糖尿病動脈粥硬化具有一定的防治作用[8-9]。本研究擬通過觀察冠心通絡方對糖尿病大鼠氧化應激、炎癥反應及主動脈組織中PI3K/Akt蛋白表達的影響，試探討冠心通絡方對糖尿病動脈粥樣硬化的作用機制。

材料與儀器

1 實驗動物

63只雄性SD大鼠（300±20）g，購買于廣州中醫藥大學實驗中心，實驗動物生產許可證號:SCXK（粵）2013-0034。飼養條件:廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗室，自由進食飲水，人工照明，明暗交替12h/12h，室溫22～24度，相對濕度67%，通風良好。

2 藥物與試劑

冠心通絡方（黃芪30g，白參10g，麥冬15g，葛根30g，丹參15g，赤芍10g，紅花10g，瓜蔞殼30g，地龍10g，甘草5g）由廣州中醫藥大學深圳醫院中藥房提供。阿托伐他汀鈣片鈣10mg/片（美國輝瑞制藥有限公司，批號H20051408）。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma；檸檬酸鈉緩沖液，北京雷根生物技術有限公司；PI3K-1小鼠單克隆抗體、Akt-1兔多克隆抗體，英國Ab-cam公司；BCA法蛋白含量檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化酶標記山羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；大鼠C反應蛋白試劑盒、白細胞介素6試劑盒，上海華壹生物科技有限公司。

3 方法

3.1 動物造模分組及給藥 63只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為正常對照組11只和造模組52只。正常對照組給予標準普通飼料；造模組采用高糖高脂飼料+灌胃高糖高脂乳+飲用蔗糖水的方法聯合喂養6周。7周后若體質量符合實驗標準者為食源性肥胖大鼠，在此基礎上進行造模，其余淘汰，共有50只大鼠符合食源性肥胖標準。禁食12h后，造模組大鼠一次性小劑量（28mg/kg）腹腔注射STZ，正常對照組腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，各組以原飼料繼續喂養。實驗第12周后經尾尖端采血測空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多飲、多尿、多食現象確定為糖尿病模型大鼠，共有45只入組。將入組大鼠隨機分為模型組、冠心通絡方組和阿托伐他汀鈣片組各15只。冠心通絡方組大鼠給予冠心通絡方溶液17.325g/kg灌胃，阿托伐他汀鈣片組大鼠給予阿托伐他汀鈣片水溶液1.05mg/kg灌胃。藥物干預一共12周。

3.2 一般情況 每天觀察大鼠活動及精神狀態、毛色、飲食、二便等情況。

3.3 血液采集和標本制備 末次給藥后禁食12h，腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，PBS灌注完畢后迅速處死大鼠取出主動脈，冰鹽水沖洗后放入10%中性甲醛固定，其余部分組織放入-80℃冰箱中保存。

3.4 血生化指標測定 使用生化分析儀檢測空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白；使用ELISA試劑盒檢測C-反應蛋白、IL-6；使用生化試劑盒檢測丙二醇、超氧化物歧化酶，嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

3.5 Westernblot 分別取主動脈組織50mg 加入0.5ml PIPA裂解液提取組織總蛋白，用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。配置SDS聚丙稀酰胺凝膠。每個樣品上樣20ug，恒流300mA轉膜60min，放入5%封閉液中封閉1h，洗膜5min，將膜分別加入一抗PI3K-1（1:1000）和Akt-1（1:1000），4℃ 孵育過夜，洗膜3次，每次10min。再將膜放入相應二抗溶液的自封袋中，搖床上搖動50min，洗膜3次，每次10min。在暗室中用ECL試劑盒發光顯影，Geo-Pro軟件分析相關條帶灰度值。

4 統計學方法

所有數據均用均數±標準差（±s）表示。應用SPSS19.0軟件進行統計分析。多組間數據比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組大鼠一般狀況

正常組大鼠行動活躍，精神狀態良好，毛色有光澤，攝食量、飲水量、體質量均正常；模型組、冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組大鼠反應遲鈍，精神萎靡不振，毛色暗黃無光澤，攝食量、飲水量明顯增多，體質量減輕，符合糖尿病“三多一少”的特征；與模型組相比，冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組大鼠一般狀況有一定程度的改善。

2 各組大鼠血糖比較情況

對于血糖的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組，空腹血糖、糖化血紅蛋白明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，冠心通絡方組的空腹血糖及糖化血紅蛋白下降明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），而冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 各組大鼠炎癥指標比較情況:

對于炎癥指標的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組的CRP及IL-6明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組的CRP及IL-6均明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），提示冠心通絡方及阿托伐他汀鈣片均能改善2型糖尿病大鼠的炎癥反應狀態。冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

4 各組大鼠氧化應激指標比較情況:

對于氧化應激指標的影響，與空白組相比，模型組、冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組的SOD水平明顯下降、MDA水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，冠心通絡方組、阿托伐他汀鈣片組SOD活性明顯上升，MDA水平下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示冠心通絡方及阿托伐他汀鈣片均能改善2型糖尿病大鼠的氧化應激水平。冠心通絡方組及阿托伐他汀鈣片組組間相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血糖、氧化應激及炎癥指標

5 各組大鼠PI3K/Akt蛋白表達比較情況:

與空白組比較，模型組、冠心通絡方組、阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中PI3K的表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，冠心通絡方組、阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中PI3K的表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而冠心通絡方組與阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中PI3K的表達相比無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

與空白組比較，模型組、冠心通絡方組、阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中Akt的表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，冠心通絡方組、阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中Akt的表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而冠心通絡方組與阿托伐他汀鈣片組的主動脈組織中Akt的表達相比無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠PI3K/Akt指標。

討論

糖尿病患者長期處于高血糖狀態下，會逐漸引起血管壁增厚、管腔變窄、管腔閉塞，甚至導致心血管事件的發生。高血糖環境下會誘發體內氧化應激亢進、抗氧化能力下降，致使活性氧在體內大量蓄積，從而導致組織和細胞損傷，引起小動脈纖維病變、動脈硬化[10]。此外，糖尿病、動脈粥樣硬化經研究證實是炎癥性疾病[11]，糖尿病患者血管壁存在持續慢性炎癥反應，釋放多種炎癥因子直接損傷血管內皮，引起氧化應激反應。高血糖、氧化應激、炎癥反應三者互為影響，加速動脈粥樣硬化的進展，共同參與了糖尿病動脈粥樣硬化的病理過程。

PI3K/Akt 信號通路是細胞內重要的生存通路之一，參與調控細胞增殖、生長、分化及凋亡等多種生物學過程[12]。PI3K/Akt 信號通路的活化可以促進組織對葡萄糖的攝取，減弱胰島素抵抗，此外還可以保護血管內皮細胞等[13]。在高糖導致的動脈粥樣硬化的發病機理中，Akt起主要作用，Akt是PI3K信號通路下游的重要蛋白，PI3K/Akt 信號通路廣泛參與了動脈粥樣硬化的形成過程，包括平滑肌細胞增生、炎癥細胞聚集等[14]。PI3K/Akt 信號通路在高血糖情況下可受到抑制，從而促進了心肌細胞凋亡，而維持該通路活化，可改善高葡萄糖造成的內皮細胞損傷[15-16]。據此推測PI3K/Akt通路可能通過調控炎癥及氧化應激對糖尿病動脈粥樣硬化發揮作用。

祖國醫學把糖尿病血管病變歸屬于消渴病的兼證，中醫理論認為，糖尿病血管病變在臨床上多以胸悶、胸痛為主癥，其病機多為本虛標實，本虛是以氣陰兩虛為主，標實則以絡阻血瘀多見，臨床調查也發現氣陰兩虛夾瘀證是糖尿病血管病變的主要證型，所占比例高達80%以上[17]，因此氣陰兩虛、絡阻血瘀是糖尿病血管病變的基本病機、核心病機。治療原則以益氣養陰，活血化瘀為法。動物實驗和臨床研究都表明以“益氣養陰、活血化瘀”的中藥復方可以延緩糖尿病動脈粥樣硬化的發生、發展，可明顯緩解患者臨床癥狀、改善預后、無嚴重不良反應，對糖尿病血管病變病變具有防治作用[18-19]。

冠心通絡方是我院研制已應用于臨床多年的中藥制劑，根據中醫經典名方補陽還五湯化裁而來，用于冠心病心絞痛的治療，該方以黃芪、白參為君藥，重用黃芪大補脾胃之元氣，加用白參更加彰顯補氣益氣之功，氣行則血行；麥冬、葛根為臣藥，養陰增液、生津止渴；丹參、赤芍、地龍、紅花、瓜蔞為佐藥，活血化瘀、通經活絡；甘草為使藥，調和諸藥。全方標本兼治，補而不滯，化瘀而不傷正，有益氣養陰、活血化瘀之功，契合糖尿病血管病變“氣陰兩虛、絡阻血瘀”的病機。在前期的研究中[20]，動物實驗已證實冠心通絡方可以擴張冠狀血管，抑制血小板聚集、粘附，降低主動脈組織MCP-1、PKC-α表達，抑制炎癥增殖，減輕血管內膜增生和血管平滑肌增殖等，從而防止血管再狹窄，提示該方對動脈粥樣硬化有一定的防治作用。

研究表明糖化血紅蛋白每增加1%，發生心血管疾病的相對危險度增加18%，從而提示糖化血紅蛋白與糖尿病血管病變密切相關。SOD和MDA是常用反映氧化應激的指標，SOD活性下降會導致氧自由基代謝產物在體內堆積，MDA含量高低則可間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，二者能較為客觀的反應體內氧化應激水平。糖尿病血管病變時炎癥因子反應活躍，糖尿病患者中CRP水平明顯升高，其是糖尿病血管病變的致病因子與預測因子，IL-6能促進其他炎癥因子的釋放，其水平的變化可以反應動脈壁的受損程度。從本研究中可以看到，經冠心通絡方干預12周后，可以明顯降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、CRP、IL-6、MDA的水平，提高SOD水平，提示冠心通絡方可以降糖，抑制氧化應激損傷，減少炎癥反應。冠心通絡方中黃芪、白參、葛根、紅花、赤芍等經現代藥理學研究已經證實具有降糖、清除氧自由基、抗炎等作用。經冠心通絡方治療后，可提高糖尿病大鼠主動脈組織中PI3K/Akt蛋白的表達，從而推測其抑制或延緩2型糖尿病大鼠動脈粥樣硬化的機制與提高主動脈組織中PI3K/Akt蛋白的表達相關，從而發揮了降糖、改善氧化應激反應和炎癥反應的作用。

不過，本實驗的樣本量小，且對機制的研究較為表淺，PI3K/Akt通路是多種通路互相交聯的樞紐，對該通路的調控機制尚未完全清楚，需要更大樣本量的研究進行進一步確認。