基于網絡藥理學探討枳實薤白桂枝湯與人參湯“皆主胸痹”的科學內涵

王夢薇 張迪 陸瑞敏 王文雅 張雪麗 陳萌

心絞痛(angina pectoris)主要是由冠狀動脈痙攣或阻塞、心肌暫時缺血或缺氧所引起的心血管疾病，相當于中醫的“胸痹”，是臨床多發疾病，其發病率呈現逐年增高的趨勢[1]。心絞痛如果得不到有效的緩解和治療，隨時可出現心律失常、心肌梗死或心力衰竭等惡性并發癥。西藥治療心絞痛存在耐受性差、耐藥性強、不良反應重等問題，中醫藥在治療心絞痛方面具有特有優勢[2]。枳實薤白桂枝湯和人參湯[3-4]治療心絞痛在臨床上已被廣泛使用，并取得了顯著的療效。

《金匱要略》云：“胸痹心中痞，留氣結在胸，胸滿，脅下逆搶心，枳實薤白桂枝湯主之；人參湯亦主之。”歷代醫家對枳實薤白桂枝湯與人參湯皆主胸痹的認識眾說紛紜。一部分學者認為，兩復方適用于胸痹病的不同階段，枳實薤白桂枝湯應用于急性期，而人參湯則應用于緩解期；一部分學者認為該條所述的胸痹病分為虛實二證，偏于實者用枳實薤白桂枝湯，偏于虛者用人參湯；也有學者認為兩方皆主胸痹是為體現仲景“心胃同治”的思想[5]。目前，針對兩方治療胸痹的對比研究多停留在理論或臨床研究，其藥物活性成分以及作用機制的研究相對較少，值得進一步深究。

網絡藥理學是基于“多成分—多靶點—多途徑”綜合調控的中藥機理研究方法，能夠系統的反映藥物對疾病網絡的干預機制，從整體探索中藥和機體的作用關系[6]。本研究采用網絡藥理學的方法，構建枳實薤白桂枝湯和人參湯相關的網絡靶點及相關活性成分，通過分析兩復方治療心絞痛的關鍵靶點、蛋白以及相關通路，為進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 枳實薤白桂枝湯和人參湯中藥物活性成分的篩選與收集

枳實薤白桂枝湯由枳實、厚樸、薤白、桂枝、栝蔞實5味藥組成，人參湯由人參、甘草、干姜、白術4味藥組成。將上述9味藥分別輸入TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)[7]和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)檢索并收集所有單位藥物的活性成分。借助TCMSP平臺的ADME參數，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選單位藥物的活性成分。

1.2 枳實薤白桂枝湯和人參湯中藥物潛在作用靶點的預測

應用TCMSP分析平臺，在線搜索枳實薤白桂枝湯和人參湯單味藥物活性成分的靶點信息，應用Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Drugbank數據庫檢索已篩選活性成分的靶點，限定物種為人，剔除沒有靶點或靶點信息不明確的化合物。使用UniProt(http://www.uniprot.org)進行靶點—基因名轉換，將檢索得到基因名校正為官方名稱(official symbol)。

1.3 心絞痛相關靶點篩選

預測疾病靶點的信息參考6個疾病數據庫：HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、OMIM(http://omim.org/)[8]、TTD (http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[9]、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)[10]、DisGeNET(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu)、HPO(https://hpo.jax.org/app/)，以“Angina Pectoris”作為關鍵詞進行搜索，分析對比后，歸納整理對心絞痛有明確作用的基因。

1.4 活性成分—藥物靶點、活性成分—疾病作用靶點網絡構建及拓撲分析

根據上述篩選以及預測結果，將兩復方的活性成分所對應的靶點基因與心絞痛相關的靶標基因進行匹配，使用 Cytoscape3.7.1軟件構建如下網絡：(1)枳實薤白桂枝湯及人參湯的活性成分—藥物潛在靶點網絡圖；(2)枳實薤白桂枝湯及人參湯治療心絞痛的活性成分—疾病作用靶點網絡圖。運用Network Analyzer工具進行拓撲分析，通過計算網絡中各節點的介數中心性(betweenness centrality)以及度(degree)，評價分析枳實薤白桂枝湯和人參湯的關鍵化合物以及靶點。

1.5 蛋白質相互作用網絡構建及分析

使用String數據庫(https://string-db.org/)[11]進行共有靶點蛋白質—蛋白質相互作用網絡(PPI)、枳實薤白桂枝湯特有治療心絞痛網絡圖(PPI)、人參湯特有治療心絞痛網絡圖(PPI)，設置物種為“Homo sapiens”(人)，置信度得分≥0.4，獲得最終的蛋白質相互作用網絡圖，從共有靶點與特有靶點不同屬性角度解釋“同病異治”的科學內涵。

1.6 生物過程通路富集分析

運用R 3.6.1軟件對交集靶點基因進行GO生物過程以及KEGG信號通路分析，ClusterProfiler是基于R語言開發的Bioconductor軟件包，可以對基因集合或基因cluster進行功能聚類的統計分析和可視化。設定pvalueCutoff=0.05，進行GO以及KEGG通路富集分析，篩選排名前二十的GO生物學途徑，繪制柱狀圖和KEGG通路繪制氣泡圖，以找到枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點相關的重要信號通路。

2 結果

2.1 枳實薤白桂枝湯和人參湯中藥物活性成分篩選及作用靶點預測

借助TCMSP、Swiss Target Prediction和Drugbank數據庫，篩選高可信度的基因作為候選靶點。篩選結果如下：枳實薤白桂枝湯的藥物活性成分和靶點數分別是43個和200個；人參湯的藥物活性成分和靶點數分別是111個和212個(表1)。

表1 枳實薤白桂枝湯和人參湯成分—靶點的基本信息

通過對比分析，兩復方共有的藥物活性成分和靶點數分別是4個和183個。枳實薤白桂枝湯和人參湯的成分—靶點網絡總共包括379個節點，1891條邊，其中紅色代表人參湯的活性成分，綠色代表枳實薤白桂枝湯的活性成分，紫色代表兩個方中共有的活性成分，橙色代表人參湯潛在的作用靶點，黃色代表枳實薤白桂枝湯潛在的作用靶點，藍色代表兩復方共同的作用靶點，每條邊表示活性成分與靶點之間的相互作用關系。從靶點角度來說，兩復方中存在多成分多靶點共同作用的機制，符合中藥復方的特點(圖1)。

圖1 枳實薤白桂枝湯和人參湯成分—靶點網絡圖

2.2 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛作用靶點分析

通過全面查找6個疾病數據庫，共篩選得到219個相關的靶點，進一步將藥物作用靶點與心絞痛疾病靶點進行關聯。枳實薤白桂枝湯和人參湯共有的183個靶點中有31個與心絞痛相關，占心絞痛疾病靶點數目的14.16%，而枳實薤白桂枝湯和人參湯與心絞痛相關的特有靶點均只有1個(圖2)，說明兩復方治療心絞痛的生物學基礎及其相似。枳實薤白桂枝湯中與心絞痛相關的活性成分有22個，人參湯中有67個，分別占該復方總活性成分的51.16%和60.36%。此外，兩復方共有的活性成分僅為4個，而與心絞痛相關的則有3個，說明兩復方治療心絞痛的作用機理可能存在高度的相似性。兩復方治療心絞痛的共有靶點中有30個可被naringenin、quercetin、beta-sitosterol三個共有活性成分作用，表明上述三個活性成分是兩復方治療心絞痛的關鍵藥物成分。三種成分主要存在于枳實、薤白、桂枝和甘草、人參、干姜6味藥當中，一定程度上反映了這6味藥在治療心絞痛相關疾病中的關鍵作用。

圖2 藥物潛在作用靶點與疾病靶點的韋恩圖

2.3 網絡構建及拓撲分析

借助Cytoscape 3.7.1軟件對藥物活性成分—疾病作用靶點進行網絡可視化，得到了包含122個節點，356條邊的網絡，其中黃色代表兩復方治療心絞痛的共同靶點，綠色代表人參湯治療心絞痛的特有靶點，粉色代表枳實薤白桂枝湯治療心絞痛的特有靶點，藍色代表兩復方治療心絞痛的共有活性成分，青色代表人參湯治療心絞痛的特有活性成分，紫色代表枳實薤白桂枝湯治療心絞痛的特有活性成分。每條邊則表示活性成分與靶點之間的靶向作用關系(圖3)。在網絡中，節點度代表節點相連的邊數，以betweenness centrality和degree來評估節點在網絡中的重要性，篩選連接活性成分或靶點較多的節點，這些節點在整個網絡中起到了樞紐的作用，可能為關鍵的活性成分或者靶點。在枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點相互作用的網絡圖中，靶點度排名靠前的有SCN5A、ADRB2、KCNH2、PON1、APOB等，分別與67、53、27、6、4個藥物活性成分發生相互作用。枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點相互作用網絡中拓撲屬性分析前20位的靶點見表2。

表2 枳實薤白桂枝湯和人參湯共有靶點的拓撲參數

圖3 枳實薤白桂枝湯和人參湯活性成分—作用靶點—疾病相互作用網絡圖

2.4 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的蛋白質—蛋白質作用網絡

使用String數據庫，構建兩復方治療心絞痛共有靶點的蛋白質—蛋白質相互作用網絡圖，該網絡含有31個節點，203條邊，平均節點degree值為13.1(圖4)。以degree值作為該網絡核心基因分析的主要參考依據，篩選排名前15名的共有靶基因，其中度排名最靠前的6個分別是IL-6、VEGFA、CCL2、IL-10、IL-1B、SERPINE1(圖5)。另外，枳實薤白桂枝湯治療心絞痛特有靶點的相互作用網絡圖有32個節點，220條邊；人參湯治療心絞痛特有靶點的相互作用網絡圖有32個節點，207條邊。

圖4 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點蛋白質—蛋白質相互作用網絡

圖5 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點(TOP15)

2.5 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點的KEGG通路分析

運用R3.6.1對枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的共有靶點進行KEGG信號通路分析。排除寬泛的通路，篩選排名前20的通路(表3)。本研究發現枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛的共有靶點富集于HIF-1信號通路、IL-17信號通路、細胞因子及其受體的相互作用、NF-κB信號通路、Th17細胞分化上。這些信號通路被證明與心絞痛密切相關。

表3 枳實薤白桂枝湯和人參湯治療心絞痛共有靶點KEGG通路分析

2.6 兩復方治療心絞痛核心靶點的KEGG通路分析

通過R 3.6.1軟件分別對兩復方治療心絞痛的核心靶點進行KEGG通路的富集分析，枳實薤白桂枝湯治療心絞痛靶點的代謝通路前20名參見圖6；人參湯治療心絞痛靶點的代謝通路前20名參見圖7。結合上述分析可以看出富集的通路大致相似，表明兩復方治療心絞痛的作用機制可能主要依賴于其中的共有活性成分。

圖6 枳實薤白桂枝湯治療心絞痛作用靶點的KEGG通路分析

圖7 人參湯治療心絞痛作用靶點的KEGG通路分析

3 討論

網絡藥理學是以中醫藥理論為指導，體外虛擬篩選中藥復方活性物質，潛在作用靶點以及通路的現代化研究方法，其研究體現的整體性特點與中醫的整體觀念相契合，是中藥復方研究中的重要方法之一。網絡藥理學在中藥復方的作用機制、藥效物質基礎、配伍規律、復方優化、“效—毒”網絡等研究中均有廣泛應用，被認為是近代生物醫藥研究的哲學觀念與研究模式的革命性轉變[12-13]。

本研究發現，枳實薤白桂枝湯和人參湯中共有的活性成分為4個，共有的靶基因187個，其中屬于共有活性成分對應的靶基因有167個。兩復方治療心絞痛的共同靶基因有31個，其中屬于共有活性成分的靶基因有30個，說明3個共有活性成分在治療心絞痛方面最為關鍵。上述靶基因的主要作用為調控炎癥反應、保護血管內皮、調節離子通道等。炎癥相關因子是心血管疾病的中藥預測指標[14]，不穩定型心絞痛患者機體炎癥反應活躍，在兩復方治療心絞痛的靶點中IFNG、IL-10、IL-6等[14]均與炎癥反應密切相關，提示兩復方可能通過調控炎癥反應治療心絞痛。SCN5A是心臟鈉離子通道編碼基因的家庭成員，可以編碼心肌鈉離子通道的成孔離子傳到的α亞基[15]。大量研究發現，SCN5A的突變與心房顫動、心律失常等多種心臟疾病密切相關[16-17]。ADRB2是G蛋白偶聯腎上腺素受體家族成員之一，可以特異性的結合內源性配體，從而產生生物效應[18]。ADRB2在心血管平滑肌細胞、心肌細胞中廣泛表達，而ADRB2的突變可以導致心肌梗死或冠狀動脈疾病[19]。KCNH2是編碼快速激活延遲整流鉀離子通道蛋白α亞單位的基因，研究發現，該基因的突變是導致心律失常的重要基礎[20]。兩復方尚可調控PON1、APOB、LDLR等血脂代謝相關基因，APON1可降低低密度脂蛋白水平[21]，LDLR基因的缺失會導致動脈粥樣硬化斑塊的形成[22]，上文提到的ADRB2也被證明在脂類代謝中具有重要作用[23]。此外，大量研究表明芳香烴受體信號通路(AHR信號通路)與心血管疾病密切相關，該通路可以影響心臟功能、血管的發育以及調節血壓[24]，而在本研究中，與該條通路相關的基因包括AHR、CYP1A2、CYP1A1、CYP3A4、AHR信號通路的靶基因細胞色素P450超家族成員(如CYP1A1)、還原型輔酶Ⅱ、醌氧化還原酶和乙醛脫氫酶，這些靶基因與氧化代謝反應密切相關，AHR基因的缺失還會影響VEFG等基因的表達。這些都提示了該通路可能是兩復方治療心絞痛的重要機制之一。此外，兩復方的共有靶點較多，但與心絞痛相關的靶點僅占14.16%，說明兩復方可能在其他疾病中仍存在“同病異治”的情況，臨床上可進一步探索。

枳實薤白桂枝湯特有靶點為金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)，該基因是基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo protein-9,MMP-9)活性的主要抑制物，MMP-9是粥樣斑塊破裂的中藥促進因素，兩者間的平衡是維持細胞外基質完整性和改善血管重構的關鍵。因此，TIMP1可能通過調控MMP-9，從而抑制斑塊破裂[22]。而人參湯的特有靶點為單胺氧化酸A(monoamine oxidase A,MAOA)，該基因對心絞痛的作用機制研究較少，但有大量研究表明，該基因與對5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、NE等具有較高親和力[25]，5-HT受體不僅可以調控心臟傷害性感受以及早期動脈粥樣硬化，因此MAOA可能通過作用于5-HT，從而在心絞痛的治療中發揮作用。以上所述從側面說明了枳實薤白桂枝湯用于胸痹急性期，而人參湯用于胸痹緩解期(調養期)的說法。

KEGG通路的富集結果顯示，兩復方治療心絞痛相關的信號通路包括低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)、IL-17、細胞因子及其受體的相互作用、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、輔助性T細胞17(T helpercell 17,Th17)細胞分化等信號通路，這些信號通路均被驗證與心絞痛的發病相關。有研究指出HIF-1α在心臟保護的調節中發揮著重要作用[26]，該基因有助于組織重塑[27]。NF-κB通路可以通過調節炎癥和細胞存活發揮關鍵作用[28]，在不穩定型心絞痛患者的外周單核細胞中可被選擇性激活，兩復方治療心絞痛可能通過抑制該信號通路從而抑制炎癥反應，可能是治療心絞痛的潛在機制。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法初步闡明枳實薤白桂枝湯和人參湯“皆主胸痹”的作用機制，揭示了中醫藥多成分、多靶點、多途徑的治療優勢，為后續兩復方的分子機制研究提供了新線索，也為中醫藥“異病同治”研究提供了新思路。