烏萸湯對高齡小鼠卵母細胞的能量代謝相關影響

鄭凌琦 黃文玲 劉艷霞 徐彩

在有生育需求的高齡女性中，因卵巢衰老而出現的卵細胞質量下降是導致不孕及輔助生殖技術失敗的主要原因。臨床上，對高發育潛能、高受精能力、高胚胎發育能力的高質量卵母細胞的要求日益增加。面對高齡女性助孕需求，如何防治卵巢衰老、保護卵巢功能、改善生育能力成為了生殖醫學界關注的熱點問題，也是其治療的重點難點。已有大量臨床研究證明，中醫治療卵巢衰老相關疾病能取得良好的治療效果，甚至恢復生育功能[1]，且中醫藥在輔助生殖技術中改善卵巢功能的作用逐漸被醫學界認可。本研究采用未成熟卵母細胞體外成熟(in vitro maturation, IVM)技術，探討烏萸湯對體外培養的高齡小鼠卵母細胞能量代謝相關影響，進而證實烏萸湯促進卵母細胞成熟的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雌性6周齡20只，體質量(18.5±0.6) g,24周齡60只，體質量(28.8±1.3) g；SPF級SD大鼠，雄性6周齡6只，體質量(150±20) g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。以上動物均飼養于北京中醫藥大學東方醫院實驗中心動物屏障系統內，SPF環境，12小時/12小時，動物自由飲水攝食。

1.2 主要實驗藥物、儀器與試劑

烏萸湯藥物組成：山茱萸10 g、烏藥10 g、菟絲子15 g、丹參10 g、雞血藤15 g、肉蓯蓉10 g、香附10 g，北京中醫藥大學東方醫院顆粒藥房提供，康仁堂藥業生產。

超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-1FD，中國)，CO2培養箱(SANYO XD-101，日本)，生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51，德國)，體式顯微鏡(世紀科信，中國)，臺式低速離心機(上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠，80-2，中國)，低溫離心機(Sigma，3-30K，德國)，酶標儀(Thermo，MULTISKAN MK3)，熒光顯微鏡(OLYMPUS-IX51，德國)，PVDF膜(0.45μm，Millipore，IPVH00010)，電泳儀(北京百晶生物技術有限公司，BG-subMIDI)，SDS-PAGE電泳系統(BIO-Rad，美國)，脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，TS-100)。

山茱萸環烯醚萜苷類提取物(上海陶素生物科技，登記號：131189-57-6)，孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(寧波三生生物科技有限公司，批號：S200808)，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(寧波三生生物科技有限公司，批號：B200805)，M2培養基(Sigma，貨號：M7167)，石蠟油(Sigma，貨號：M8410)，羊抗兔-HRP(博奧森，貨號：bs-0295G-HRP)，β-actin(proteintech，貨號：20536-1-AP)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPKα)(CST，貨號：5831)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPKα)(CST，貨號：2535)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)(GeneTex，貨號：GTX31921)，蛋白marker(Thermo，貨號：26617)。三磷酸腺苷ATP檢測試劑盒(Sigma，貨號：MAK190)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(碧云天，貨號：S0101)，活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(普利萊，貨號：C1300-1)，Mito-Tracker Green熒光探針標記線粒體染色(碧云天，貨號：C1048)，JC-1線粒體膜電位熒光探針(索萊寶，貨號：J8030)。

1.3 含藥血清制備

取雄性6周齡SD大鼠6只，烏萸湯連續灌胃7天，據李玲等[2]前期實驗最優效劑量，灌胃藥物按原藥材濃度4.8 g/mL配制，每日灌胃1 mL/100 g藥液，于第7天灌胃后1小時腹主動脈取血，3000 rpm離心15分鐘，分離血清，將同組血清混勻，以0.22 μm濾器抽濾除菌，56℃滅活，分裝，-20℃保存備用。

1.4 原代細胞提取

(1)培養液解凍24小時以上，配置M2培養基為基礎培養基，含藥培養基用基礎培養基將藥物稀釋至烏萸湯含藥血清10%、山茱萸環烯醚萜苷類提取物20 mg/L，分別稱為烏萸湯培養基、山茱萸提取物培養基。

(2)在培養皿中做好清洗液滴(M2培養液)，培養液滴(基礎培養基、烏萸湯組培養基、山茱萸提取物組培養基)，每滴20 μL，覆蓋2 mL石蠟油后置于37℃、 5%CO2恒溫培養箱平衡過夜。

(3)雌性清潔級C57BL/6J小鼠6、24周齡分別腹腔注射10 IU PMSG，間隔48 小時后再注射10 IU HCG，16小時后頸椎脫臼處死小鼠，在超凈臺中取出卵巢，轉移至體式顯微鏡下用注射器針頭將其扎破，待內含物溢出后挑取卵丘卵母細胞復合體(cumulus-oocytes complex, COCs)，整個過程于15分鐘內完成。

(4) 將所取得COCs置于預先平衡的培養液滴中清洗2～3次，轉移至培養液滴中培養，控制每個液滴培養的COCs數量為10個，每個培養皿有10個含卵母細胞培養液滴。

1.5 細胞分組及培養

細胞共分為4個組：青年組：6周齡小鼠卵母細胞培養于基礎培養基中；高齡組：24周齡小鼠卵母細胞培養于基礎培養基中；烏萸湯組：24周齡小鼠卵母細胞培養于烏萸湯組培養基中；山茱萸提取物組：24周齡小鼠卵母細胞培養于山茱萸提取物組培養基中。

1.6 各觀察指標檢測方法

各組以放進培養箱為0小時，培養24小時后進行相關指標觀察檢測。

1.6.1 卵母細胞第一極體排出率 培養24小時后，隨機選取20個細胞觀察卵母細胞是否排出第一極體，第一極體排出率=排出第一極體的細胞數/總觀察細胞數×100%。

1.6.2 卵母細胞ATP含量檢測 采用熒光檢測/比色的方法進行ATP濃度檢測，各組收集20個培養液滴的卵母細胞，按照說明書進行檢測。每組細胞置于96孔板不同孔中，用50 μL裂解液裂解細胞；另取0、2、4、6、8、10 μL的1 mmol標準品加入96孔板，最終每孔ATP含量為0、2、4、6、8、10 nmol，用水補齊至50 μL；每孔加50 μL反應液，混勻，室溫反應30分鐘；測570 nm處吸光度。去掉背景干擾值，根據標準品繪制標準曲線，計算每組卵母細胞的ATP濃度。

1.6.3 卵母細胞線粒體含量測定 利用熒光顯微鏡觀察Mito-Tracker Green熒光探針標記線粒體，按照說明書進行。取1 mmol/L儲存液按照1∶5000的比例加入到細胞培養液中，最終濃度為200 nmol；各組收集20個培養液滴，去除細胞培養液，加入使用前37℃預溫育染色工作液，與細胞37℃共孵育15分鐘；去除工作液，加入37℃預溫育的新鮮細胞培養液；熒光顯微鏡觀察拍照，根據其綠色熒光強度大小，反映卵母細胞線粒體含量高低。

1.6.4 線粒體膜電位變化檢測 采用JC-1熒光探針法觀察線粒體膜電位的變化。每組收集20個培養液滴并吸除培養液，用PBS溶液洗滌后加入1 mL細胞培養液、JC-1染色工作液，充分混勻；細胞培養箱中37℃孵育20分鐘；吸除上清，用PBS洗滌2次；再加入1 mL細胞培養液，熒光拍照觀察，測定紅色熒光和綠色熒光的比值作為線粒體膜電位的變化值。

1.6.5 卵母細胞SOD酶活性檢測 采用WST-8法檢測卵母細胞SOD酶含量，按照說明書指示進行。各組收集20個培養液滴中的卵母細胞，用4℃或冰浴預冷的PBS或生理鹽水洗滌1～2遍，沉淀后在4℃或冰浴進行勻漿，勻漿液4 ℃離心，取上清作為待測樣品；96孔板設置樣品孔和各種空白對照孔，依次加入待測樣品、SOD檢測緩沖液、WST-8/酶工作液、反應啟動工作液，混勻后在37℃孵育30分鐘；在450 nm處測定吸光度。根據試劑盒所述方法計算SOD酶活力單位。

1.6.6 卵母細胞ROS檢測 利用DCFH-DA探針法檢測卵母細胞ROS含量，操作步驟按說明書指示。各組收集20個培養液滴，去除細胞培養基上清，加入用無血清培養液稀釋好的探針(探針終濃度為10 μmol)37℃孵育細胞30分鐘；棄去上層培養液，用無血清培養液或0.01 mol PBS反復吹打，使細胞層全部進入PBS或培養液中；收集細胞懸液，用0.01 mol PBS或無血清培養液洗滌2次，去除未進入細胞內的探針，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞，熒光拍照觀察。熒光強度大小反映卵母細胞線粒體含量高低。

1.6.7 卵母細胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白的表達 為了了解線粒體的功能，檢測ATP產生相關的AMPKα、p-AMPKα、PCG-1α蛋白的表達，采用Western Blot法測定蛋白含量。在4℃下將已加入裂解液的卵母細胞，12000 rpm離心10分鐘，取上清液，BCA法蛋白定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為50 μg蛋白；以每塊膠80 V濃縮膠，120 V分離膠，恒壓電泳，當目的蛋白處于分離膠面的下1/3的最佳分辨位置時停止電泳分離；4℃、110 V/120 mA恒流濕轉；將剪切好的PVDF膜放到甲醇中浸泡10秒，室溫搖床封閉2小時，然后分別加入稀釋后一抗AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α及β-actin，4℃孵育過夜轉膜；洗去多余一抗，加入稀釋HRP，37℃搖床孵育1小時；洗去多余二抗后顯色曝光，使用Image J軟件分析灰度值。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 第一極體排出率

青年組排出率為65%(13/20)，高齡組排出率為15%(3/20)，烏萸湯組排出率為45%(9/20)，山茱萸提取物組排出率為35%(7/20)。青年組第一極體排出率高于其他各組，烏萸湯組和山茱萸提取物組高于高齡組，且烏萸湯組較山茱萸提取物組略高。見表1。

表1 各組小鼠卵母細胞第一極體排出率

2.2 ATP含量

與青年組相比，高齡組、山茱萸提取物組ATP含量明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.05)，但烏萸湯組和青年組之間差異沒有統計學意義(P>0.05)；與高齡組相比，烏萸湯組和山茱萸提取物組含量有所升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠卵母細胞ATP含量

2.3 卵母細胞線粒體熒光染色定位標記、線粒體膜電位變化

Mito-Tracker Green熒光探針標記線粒體(圖1)，測定各樣本熒光強度，分析可知高齡組線粒體數量明顯低于青年組(P<0.05)，烏萸湯組、山茱萸提取物組線粒體數量明顯高于青年組和高齡組(P<0.05)。

注：Mito-Tracker Green將線粒體綠染，Hochest將活細胞藍染。

各組線粒體膜電位變化檢測(圖2)可知，高齡組膜電位變化弱于青年組(P<0.05)，但烏萸湯組、山茱萸提取物組與青年組、高齡組相比差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表3。

注：線粒體膜電位較低時顯示為綠色熒光，線粒體膜電位較高時顯示為橙紅色熒光。

表3 各組小鼠卵母細胞線粒體含量、膜電位比較

2.4 卵母細胞SOD酶活性、ROS含量

各組卵母細胞SOD酶活性比較發現，高齡組、烏萸湯組、山茱萸提取物組比青年組明顯降低(P<0.05)，烏萸湯組和山茱萸提取物組比高齡組有所升高(P<0.05)。

各組卵母細胞ROS熒光強度比較發現，高齡組、烏萸湯組、山茱萸提取物組比青年組明顯升高(P<0.05)，但烏萸湯組、山茱萸提取物組和高齡組之間差異比較無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠卵母細胞SOD活性、ROS含量熒光強度比較

2.5 卵母細胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達

與青年組比較，高齡組AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，烏萸湯組p-AMPKα蛋白的表達明顯降低(P<0.05)；與高齡組比較，烏萸湯組AMPKα、PGC-1α均有所升高(P<0.05)，山茱萸提取物組p-AMPKα有明顯升高(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組卵母細胞AMPKα、p-AMPKα、p-AMPKα/AMPKα、PGC-1α蛋白表達的比較

圖3 各組小鼠卵母細胞AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達

3 討論

數十年來，生育年齡的推遲成為全球趨勢，加之“二孩政策”開放，有生育要求的高齡女性越來越多[3-4]。高齡女性的卵巢功能下降，常表現為月經周期紊亂、對卵巢刺激反應欠佳、高流產風險甚至不孕[5]。面對日益增加的高齡女性助孕需求，如何改善卵巢功能受到了生殖醫學界的廣泛關注。卵巢功能下降，其實質為女性年齡相關的卵母細胞數量減少和質量下降。卵巢是最容易受到年齡影響的器官之一，加上社會心理因素、醫源病理因素、行為學因素、環境污染等因素的影響[6]，卵母細胞出現某些基因突變、卵巢組織的端粒酶活性異常，氧化應激狀態中酶活性下降、線粒體結構功能異常、細胞超微結構改變等，進而干擾卵細胞的正常發育，加重卵巢衰老[7-10]。最新研究表明，線粒體功能對調控卵泡閉鎖和卵細胞質量起著決定性作用[11-12]。

線粒體能夠通過氧化磷酸化產生ATP和少量ROS，是細胞一系列正常生理活動提供能量的物質基礎，它的數量及功能能夠反映細胞的生理狀態[13]。AMPK是生物能量代謝調節的關鍵分子，其下游分子PGC-1α主要調控線粒體增生，對于維持線粒體數量具有重大意義。而膜電位的穩定給線粒體提供了正常的生理環境，是線粒體功能實現的前提[14]。 由于ROS能改變線粒體通透性，所以少量的ROS對于細胞正常生理功能和細胞代謝調節具有重要作用，但高濃度的ROS就會誘發氧化應激，損傷線粒體DNA，造成線粒體DNA突變或缺失，ATP生成減少，線粒體膜上離子交換通道破壞，膜電位消失等，導致卵母細胞老化[15]。SOD是生物體內一種重要的抗氧化酶，可以清除ROS，故ROS含量及SOD活性也是評價生物體能量代謝的指標之一[16]。經本實驗研究證實，隨著小鼠年齡增大，卵母細胞線粒體數目減少、膜電位變化減弱，產生的ATP減少、ROS增加，SOD酶活性降低，AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達降低。在此過程中，SOD酶活性降低不能清除線粒體氧化磷酸化產生的多余ROS，線粒體膜電位異常，且AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α蛋白表達降低影響了線粒體增生。線粒體損傷嚴重、增生受阻，破壞了線粒體穩態，線粒體產生的ATP減少不能供給正常的細胞代謝所需，最終導致細胞能量代謝下降、氧化應激狀態減弱，卵母細胞成熟受阻，第一極體排出障礙。

中醫認為腎虛肝郁是卵巢功能下降的基本病機。由于現代女性生活、工作壓力較大，生育之心不遂，久而致郁，肝郁氣滯，日久成瘀，血瘀為實，阻塞胞宮胞絡。腎精是產生月經的物質基礎，精血同源，腎精不足，精虧血少，則沖任血虛，胞宮胞脈失養，故經水難下，胎孕難成，治宜補腎調肝。據此，國家級名老中醫金哲教授自擬經驗方烏萸湯。方中山茱萸溫能通行、辛能走散、酸能入肝，烏藥溫腎散寒，能夠補益肝腎，以益其源，共為君藥。菟絲子、肉蓯蓉溫腎益精，取陽中求陰，陰得陽生之意，共為臣藥；佐以丹參、雞血藤養血活血，香附疏肝理氣開郁。諸藥共用補腎以助先天、調肝以暢氣血，共奏補腎調肝之效而達調經種子目的。

本課題組前期研究顯示，烏萸湯可提高卵巢不敏感綜合征模型小鼠血清雌激素水平，降低促卵泡生成素、促黃體生成素水平，上調卵巢抑制素B及卵泡抑素水平，下調激活素水平，有效改善卵巢功能[17-18]。本實驗研究發現，與高齡組相比，烏萸湯組小鼠卵母細胞第一極體排出率增加、線粒體數量增多、ATP含量上升、SOD酶活性增強，p-AMPKα、AMPKα及PGC-1α蛋白表達量增加，說明了烏萸湯能夠通過改善卵母細胞線粒體能量代謝及氧化應激反應提高卵母細胞質量。

此外，目前關于卵母細胞的線粒體研究主要集中在動物層面，即治療后取卵，但控制性超促排卵的使用使得多胎妊娠和卵巢過度刺激綜合癥的發病率明顯上升[19]。為了避免此類醫源性并發癥的發生，部分學者主張采用IVM技術為卵泡發育異常的患者提供治療途徑[20]。本實驗采用取卵后治療的方式，將IVM技術運用在卵細胞體外培養當中。

綜上，本實驗在IVM技術基礎上，證實了烏萸湯能夠通過影響高齡小鼠卵母細胞的線粒體功能，改善其能量代謝和氧化應激狀態，促進卵母細胞成熟，可作為烏萸湯應用于IVM技術中提高卵母細胞質量的實驗依據。