醒腦靜注射液對大鼠腦出血模型血腦屏障通透性及相關蛋白的影響

王麗琴 孫逸坤 王曉峰 李媛媛 宋珂 劉浩琦 常靜玲 高永紅

《全球疾病，傷害和危險因素負擔研究》表明2016年全球有8000萬中風病例，死亡550萬[1]。在我國，腦卒中患者中腦出血占28.2%[2]。血腦屏障是位于腦組織與外周血液循環之間的復雜細胞結構，在維持內環境穩態方面起到重要作用[3]。血腦屏障破壞是出血性中風的突出病理特征[4]。腦出血后會導致血腦屏障通透性增加以及功能障礙，其功能障礙引起的原發性損傷可能會破壞緊密連接及內皮細胞等的結構，導致潛在的神經毒性和血管活性化合物進入大腦，最終導致神經元細胞死亡[5-6]。

研究發現，醒腦靜注射液在治療急性腦出血方面具有降壓，維持水和電解質平衡，緩解炎癥反應，神經保護等作用[7-8]。本研究采用膠原酶誘導的腦出血大鼠模型，結合病理、分子生物學等方法觀察大鼠腦出血腦組織超微結構的改變及相應的病理變化，觀察并檢測腦出血后腦組織中血腦屏障的結構變化及相關蛋白的表達，探討醒腦靜注射液減輕腦出血后繼發性損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗中所用無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級健康雄性SD大鼠27只，體質量(270±20) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。SD大鼠飼養于東直門醫院實驗動物中心，許可證號：SYXK(京)2015-0001，大鼠分籠飼養并給予充分食水。

1.2 主要試劑與儀器

醒腦靜注射液(10 mL/支)：無錫濟民可信山河藥業股份有限公司(貨號151107)；膠原酶VII：Sigma公司(貨號C0773)；伊文思藍(Evens blue, EB)：Solarbio公司; 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、預染蛋白分子量marker、山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶Goat anti-Rabbit IgG(immunoglobulin G，IgG)(H+L)HRP(horseradish peroxidase，HRP)、山羊抗小鼠免疫球蛋白G辣根過氧化物酶 Goat anti-mouse IgG(H+L)HRP：PPLYGEN公司。水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、閉合蛋白(Occludin)一抗：Abcam公司；緊密連接蛋白(tight junction protein,ZO-1)一抗：Invitrogen公司；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)一抗：Proteintech公司。

數字腦立體定向儀：美國AST公司；微量注射泵：美國HARVARD公司；微量注射器：美國Hamilton公司；光學顯微鏡：日本Olympus公司；透射電子顯微鏡：日本Hitachi公司；電泳儀：北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像系統：美國UVP公司；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰(SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳系統、ChemiDoc MP化學發光成像系統：美國Bio-Rad公司；自動脫水、包埋機、石蠟組織切片機：德國Leica公司。

1.3 實驗動物造模、分組及給藥

參考文獻[9]所述方法，隨機選取9只SD大鼠為假手術組，其余18只大鼠采用VII型膠原酶注射入尾狀核的方法來制備大鼠腦出血模型。大鼠術前禁食不禁水過夜，稱重麻醉后剃去顱頂毛發，固定于立體定向儀并調整至前后囟在同一水平面上，于顱頂正中行切口，充分暴露頭骨，以前囟為原點，右側旁開3.0 mm，向前0.5 mm(尾狀核定位點)行顱骨鉆孔。于微量注射器中吸取1 μL(0.1 u/μL)VII型膠原酶，將微量注射器固定于立體定位儀上，于鉆孔處緩慢進針，其深度為5.5 mm，注射速度為200 nL/分鐘，5分鐘完成注射，留針10分鐘后將針退出并使用骨蠟封閉顱骨鉆孔并縫合、消毒。假手術組只行鉆孔及進針。術后2小時動物清醒后采用改良的神經系統嚴重程度(modified neurologic severity scores，mNSS)評分標準[10]進行神經功能評分，評分為7～12分的大鼠視為模型建立成功。本實驗中造模大鼠及假手術組大鼠均未出現死亡。

將造模成功的SD大鼠納入實驗，隨機分為醒腦靜組和模型組，每組9只。醒腦靜組行腹腔注射醒腦靜注射液0.18 mL/100 g，假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。每隔24小時給藥一次，連續給藥3天。

1.4 EB檢測血腦屏障通透性

給藥3天后，將假手術組、模型組、醒腦靜組大鼠(每組1只)麻醉后剪開腹股溝部位皮膚，暴露股動脈，注射2%的EB染液(2 mL/kg)，經血液循環2小時后可見大鼠全身皮膚及黏膜轉為藍色。將大鼠固定于鼠板，開胸使其心臟暴露，經左心室插入灌流針直至主動脈弓，使用止血鉗固定灌流針，剪開右心耳，夾閉腹主動脈，灌注無菌生理鹽水約200 mL，至肝臟和肺臟轉為白色，然后灌注4%多聚甲醛直至腦組織固定，取出腦組織浸泡于4%多聚甲醛中，48小時后切片拍照。

1.5 透射電鏡觀察星形膠質細胞足突水腫

每組選取3只大鼠按上述灌流方法灌流后開顱取腦，于出血灶周圍取1 mm3大小的組織塊放入2.5%戊二醛電鏡固定液中固定2小時，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗3次，二甲砷酸鈉緩沖液沖洗后包埋，超薄切片機切片，經鈾染、鉛染后，使用透射電鏡觀察各組腦組織中星形膠質細胞胞體和周邊結構變化及血管周圍水腫情況。采用Image pro plus 6.0軟件分析星形細胞足突水腫面積，每只大鼠腦組織切片隨機選取15個視野取均值計算。

1.6 免疫組化檢測AQP4的表達

大鼠灌流取腦后，將腦組織進行石蠟包埋切片。常規脫蠟至水化，間接水浴鍋加熱修復法進行抗原修復，使用0.3% Triton孵育10分鐘后PBS沖洗，10%山羊血清37℃孵育30分鐘，加入AQP4一抗后于4℃冰箱過夜，復溫30分鐘，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，使用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測血腦屏障相關蛋白的表達

每組選取5只大鼠麻醉后斷頭取腦，取血腫周邊2 mm3腦組織置于凍存管中，于液氮中保存備用。加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑，超聲勻漿提取各組大鼠腦組織蛋白，離心15分鐘(4℃，12000 rpm)，取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并定量為同一濃度，煮沸20分鐘后備用。煮好的樣品進行SDS-PAGE電泳，轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，分別利用相應的抗體(β-actin、AQP4、VEGF、Occludin、ZO-1)進行孵育并于4℃環境過夜，Tris緩沖鹽吐溫(Tris Buffered saline Tween，TBST)漂洗，加入二抗孵育1小時，TBST洗膜3次，將PVDF膜浸泡于電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)顯色液中1分鐘，暗室中曝光、顯影，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 醒腦靜對腦出血大鼠腦組織血腦屏障的通透性的影響

假手術組大鼠腦切片皮質及白質均未見EB染色，表明無血腦屏障的滲漏。而模型組、醒腦靜組在出血灶周邊可見不同程度的藍染，血腦屏障的EB滲透量均有不同程度改變。醒腦靜組出血灶周邊藍染程度與模型組相比較輕，血腦屏障的滲漏程度少于模型組。見圖1。

圖1 醒腦靜注射液對大鼠血腦屏障滲漏程度的影響(EB染色)

2.2 醒腦靜對腦出血大鼠腦水腫的影響

2.2.1 醒腦靜改善腦出血大鼠腦組織星形膠質細胞足突水腫 為了進一步明確醒腦靜改善腦水腫保護血腦屏障的機制，采用透射電鏡觀察并分析星形膠質細胞足突水腫面積。結果顯示，假手術組血管基膜連續，形態規則且表面光滑，內皮胞質厚度均一，血管周圍電子密度分布均勻；腦出血后3天，模型組組織稀疏，內皮細胞結構不規則，局部膨出，部分與基膜剝離，血管周圍星形膠質細胞足突水腫明顯，血腦屏障結構破壞，通透性增加。醒腦靜組血管周圍有局部水腫，而其水腫面積明顯低于模型組，損傷程度明顯減輕(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組大鼠腦組織星形膠質細胞足突水腫程度比較

注：A.假手術組；B.模型組；C.醒腦靜組。

2.2.2 醒腦靜降低腦出血大鼠腦組織AQP4和VEGF蛋白表達 免疫組化結果顯示，模型組AQP4蛋白表達量高于假手術組，醒腦靜組AQP4蛋白表達量則低于模型組。Western blot的結果顯示，模型組AQP4和VEGF蛋白表達較假手術組明顯增高(P<0.05)；醒腦靜組表達量相比模型組明顯下降(P<0.05)。見圖3～4、表2。

注：A.假手術組；B.模型組；C.醒腦靜組。

圖4 Western blot檢測腦出血大鼠腦組織中AQP4、VEGF的表達

表2 各組大鼠腦組織中AQP4、VEGF的蛋白表達比較

2.3 醒腦靜對腦出血大鼠腦組織中Occludin、ZO-1蛋白表達的影響

Western blot的結果顯示，模型組大鼠腦組織中Occludin、ZO-1蛋白表達低于假手術組(P<0.05)，醒腦靜組Occludin、ZO-1蛋白表達較模型組增加(P<0.05)。見圖5、表3。

表3 各組大鼠腦組織中Occludin、ZO-1的蛋白表達比較

圖5 Western blot檢測腦出血大鼠腦組織中Occludin、ZO-1的表達

3 討論

中醫理論中腦出血屬于中風范疇，其基本病機為氣血逆亂致血溢腦脈之外。臟腑功能失調，內生風邪、火邪，灼脈絡，迫血行，血溢脈外而發為腦出血[11-12]。絡脈作為經絡系統的分支，對于維持人體正常的生命活動具有十分重要的意義[13]。腦絡是絡脈的一部分，相當于大腦中的“微循環”，是腦中氣血津液交換的場所[14]。腦絡灌注氣血津液充實腦髓，散布陽氣以溫煦腦神，是神機運動的物質基礎和源動力[15]。血腦屏障由顱內毛細血管內皮細胞及其緊密連接、星形膠質細胞、周細胞和基質構成，可維持離子平衡、營養物質轉運，阻止有害物質進入腦組織[16]。腦出血后，由血紅蛋白裂解釋放的有毒物質以及氧化應激和炎性浸潤等病理變化直接破壞血腦屏障、緊密連接，改變相關蛋白的表達，導致血腦屏障通透性增加，致使血腦屏障功能障礙，從而導致血管性水腫，水通道蛋白表達增加，最終導致神經元細胞死亡[4,17-18]。從結構特點和功能上，血腦屏障和腦絡具有一定的相似性。

醒腦靜具有醒腦開竅通絡的作用，其主要成分包括梔子、冰片、郁金、麝香。其中麝香氣味芳香，善于走竄，散瘀通絡，能通諸竅不利，開經絡之壅滯；冰片專于瀉火毒,辛香走竄，助麝香通諸竅，二者協同發揮開竅醒腦的作用；郁金性苦寒，化痰開郁，協同麝香、冰片二藥開竅通絡；梔子性味苦寒，清理三焦之火，解痰瘀所化生之毒邪。上述諸藥共同起到化痰通絡、涼血解毒之功[19-20]。常見的腦出血模型建立為膠原酶誘導模型和自體血模型兩種方法[21]。其中膠原酶誘導的腦出血模型中血腫的形成與人腦內血管破裂所引起的腦出血情況相似，可以較好地模擬患者腦出血急性期腦內血腫擴大的病理過程，尤其適用于研究腦出血繼發性損傷的機制和藥物對神經功能影響的作用機制[22]。因此，本研究選用該模型探討醒腦靜注射液對腦出血后繼發性腦損傷的治療效果與機制，結果表明醒腦靜能夠降低EB的通透性，改善血腦屏障功能。

星形膠質細胞上表達的AQP4、鉀離子通道可以穩定腦內水和離子的平衡，其衍生因子VEGF可通過調節緊密連接影響血腦屏障完整性和通透性，引起內皮細胞凋亡，破壞血腦屏障[23-24]。AQP4參與維持血腦屏障通透性完整性和發育過程[3]。VEGF在腦組織持續或嚴重缺氧時其表達量急劇升高可以加重腦損傷。研究表明腦出血后AQP4、VEGF表達均顯著增加，通過抑制二者的表達可有效減輕腦水腫及神經功能損傷[25-26]。本實驗發現腦出血后3天模型組星形細胞足突水腫嚴重，模型組大鼠AQP4、VEGF表達量明顯高于假手術組；醒腦靜組足突水腫程度、AQP4和VEGF的蛋白表達量明顯低于模型組，表明醒腦靜能夠調節AQP4、VEGF的表達，具有減輕腦水腫、保護神經功能的損傷的作用。

緊密連接是維持血腦屏障結構和功能完整性的結構基礎[27]。Occludin被認為是血腦屏障中一種重要的緊密連接構建蛋白，有助于細胞生長和分化，改變細胞間的通透性。ZO-1在保持血腦屏障完整性方面起著重要作用[28]。當ZO-1功能和結構發生變化后，緊密連接遭到破壞，從而導致細胞間縫隙增加，進而血管通透性增加，隨后發生血管源性水腫[27,29]。研究發現腦出血后血腫周邊的血管內皮細胞的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達均下降，這可能導致血腦屏障緊密連接的破壞[30]，通過增加緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達可減輕缺血性腦卒中大鼠腦水腫[31]。本研究中，腦出血模型組大鼠腦組織Occludin和ZO-1的表達量均顯著低于假手術組，表明模型組大鼠血腦屏障發生嚴重破壞。而醒腦靜組大鼠腦組織中Occludin和ZO-1的表達量均明顯高于模型組，表明醒腦靜能夠調節這兩種緊密連接蛋白的表達，從而保護血腦屏障的完整性。

綜上所述，本研究建立大鼠腦出血模型，觀察腦出血大鼠腦組織血腦屏障的結構及功能變化，發現醒腦靜注射液可明顯降低大鼠腦出血腦組織中AQP4、VEGF的表達，上調緊密連接蛋白Occludin、ZO-1，降低血腦屏障的通透性，減輕腦水腫。