頤腦解郁方對血管性癡呆大鼠模型甲狀腺軸功能的影響

寇娜 郝鈺 趙瑞珍 趙子珺 唐啟盛

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中等原因所致的認知功能障礙綜合征，是繼阿爾茨海默病后第二大癡呆類型，約占所有癡呆類型的20%[1-2]。多項臨床研究表明VD患者可能合并甲狀腺激素水平的變化，且低甲狀腺激素可進一步加速VD患者認知功能障礙[3-6]。VD患者多表現為思維遲滯、不寐、乏力、腰膝酸軟、胸脅脹滿、面色晦暗、舌淡或暗、苔白、脈沉細或沉弦，中醫辨證多屬腎虛肝郁證型。先前的研究表明頤腦解郁方能夠改善腎虛肝郁型VD大鼠的認知功能，但是否與調節甲狀腺激素水平相關少有報道[7]。本實驗通過觀察VD大鼠下丘腦—垂體—甲狀腺軸(hypothalamus pituitary thyroid axis，HPT)相關因子的變化，探討頤腦解郁方是否通過調節甲狀腺激素水平來改善VD大鼠的認知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠(6周齡，體質量200～220 g)由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供動物許可證：SCXK(京)2016-0006。大鼠適應性預養1周，自由攝食和飲水，動物房室溫22～25℃，相對濕度55%～65%，光照周期晝夜各12小時。

1.2 動物模型建立及分組

大鼠VD模型參考Longa等[8]報道的線栓造模方法，手術過程中室內溫度保持27～30℃，并采用數字量表評價大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)神經功能，選擇術后24小時評分為7～12分中度損傷大鼠，不予干預4周后自然癡呆經跳臺實驗篩選后選出[9]。

實驗將30只VD大鼠隨機分為VD模型組、VD中藥組，每組15只。15只假手術組大鼠除不結扎外，其余步驟完全與VD造模方法相同。正常組選取15只正常大鼠不予任何干預。其中VD中藥組大鼠灌胃中藥頤腦解郁方(大鼠灌胃劑量根據成人用量的7倍進行計算，配成419 mg/kg混懸液，每日劑量為10 mL/kg，灌胃量根據每周大鼠的體質量變化調整)。正常組、假手術組、VD模型組大鼠常規飼養，灌胃0.9%生理鹽水，每日劑量10 mL/kg，連續4周。動物保健及使用經過北京中醫藥大學倫理委員會實驗協議批準。

1.3 主要儀器和試劑

二甲苯購于天津市進豐化工有限公司；無水乙醇購于北京化工廠；促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)放免試劑盒、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)放免試劑盒、游離甲狀腺素(free thyroxine，FT4)放免試劑盒由北京華英公司提供；戊巴比妥購于國藥集團化學試劑北京有限公司。Morris水迷宮設備由北京中醫藥大學基礎醫學院提供；DTT-2跳臺儀由中國科學研究院提供；生物組織包埋機(型號YD-6L)購于金華市益迪醫療設備有限公司；石蠟切片機(型號FINESSE 325)購于SHANDON公司；超純水儀(型號D7411)購于美國Barnstead公司；光學顯微鏡(型號BN-2)購于日本Olympus公司。圖片處理運用NIS-Elements B R Version2.34及AMT Image Capture Engine圖片成像軟件完成。

1.4 主要藥品

頤腦解郁方(刺五加20 g、梔子10 g、五味子10 g、郁金10 g)購于北京中醫藥大學第三附屬醫院中藥房，配方顆粒由北京康仁堂藥業有限公司提供。灌胃劑量按照成人常用量(20 mg·60 kg-1·d-1)的7倍計算大鼠用量，濃度為0.62 g/mL，4℃冰箱冷藏備用，灌胃前加熱。

1.5 跳臺實驗

各組大鼠于灌胃1周與4周末次30分鐘后進行跳臺實驗。跳臺裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動回避反應箱，實驗時先將大鼠放入箱中訓練3分鐘，然后通36 V交流電，記錄每只大鼠第一次跳下安全區的時間(潛伏期)和錯誤次數。

1.6 Morris水迷宮

各組大鼠于灌胃1周與4周末次行Morris水迷宮實驗，記錄逃避潛伏期時間及穿越平臺次數。(1)定位航行試驗：將大鼠于第1象限入點處面向池壁放入水中，記錄大鼠在120秒內尋找并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期時間，之后分別從其他3個象限入水點將大鼠放入水中，連續訓練5天。(2)空間探索試驗：于第6天撤去平臺，在第1象限入點處將大鼠放入水中，記錄大鼠在60秒內的運動軌跡，并計算其穿越平臺次數。

1.7 下丘腦病理學觀察

各組大鼠灌胃1周與4周末次，隨機選擇6只大鼠在行為學檢測后麻醉處死，斷頭取腦組織投入預先配好的固定液(4%多聚甲醛)使其蛋白質變性凝固后，切取下丘腦部位進行常規固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀切片、再脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、常規脫水，透明，封片，觀察大鼠下丘腦病理學變化。

1.8 HPT軸相關激素TSH、FT3、FT4的含量

各組大鼠灌胃4周末次，隨機選擇8只大鼠在行為學檢測后麻醉大鼠，腹主動脈取血，4℃離心10分鐘取血清，并用全自動放免計數儀按試劑盒說明的放射免疫法測定血清TSH、FT3、FT4含量。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 跳臺實驗

與正常組相比，假手術組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期及錯誤次數均無明顯差異(P>0.05)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時間顯著下降，錯誤次數顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時間顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，錯誤次數在灌胃1周后統計無顯著性差異(P>0.05)，灌胃4周后顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 頤腦解郁方對VD大鼠跳臺實驗的影響

2.2 Morris水迷宮實驗

與正常組相比，假手術組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期與穿越平臺次數無明顯差異(P>0.05)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周逃避潛伏期時間明顯增多(P<0.05，P<0.01)；VD模型組大鼠灌胃1周穿越平臺次數顯著下降(P<0.01)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周穿越平臺次數均明顯下降(P<0.05)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時間減少，穿越平臺次數增多，但統計學無顯著差異(P>0.05)。結果見表2、表3。

表2 頤腦解郁方對VD大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期的影響

表3 頤腦解郁方對VD大鼠Morris水迷宮實驗穿越平臺次數的影響

2.3 下丘腦病理學觀察

光鏡顯示，正常組大鼠灌胃1周下丘腦神經元細胞及神經膠質細胞排列有序，細胞核大，淡染，染色質分布均勻，核仁清晰，未見變性、壞死等病變，且灌胃4周與1周相比未見差異。與正常組相比，假手術組大鼠下丘腦病理形態變化不明顯；VD模型組大鼠灌胃1周下丘腦見大片液化性壞死灶，呈篩網狀結構，壞死區內神經元細胞變性、壞死，小膠質細胞增生明顯及炎癥細胞浸潤，且大鼠灌胃4周較1周后下丘腦細胞變性、壞死程度更明顯。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周下丘腦細胞變性程度減輕，但仍見大片液化性壞死灶，呈篩網狀結構，壞死區內神經元細胞變性、壞死，小膠質細胞增生明顯及炎癥細胞浸潤，且大鼠灌胃4周較1周下丘腦細胞變性減輕明顯(見圖1)。

圖1 頤腦解郁方對VD大鼠下丘腦形態的影響(HE,×400)

2.4 HPT軸相關激素TSH、FT3、FT4含量測定

與正常組相比，假手術組大鼠血清FT3、FT4、TSH含量無統計學差異(P>0.05)；VD模型組、VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量顯著下降(P<0.05,P<0.01)，血清TSH含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，血清TSH含量顯著下降(P<0.01)。結果見表4。

表4 頤腦解郁方對VD大鼠HPT軸相關激素TSH、FT3、FT4的影響

3 討論

本實驗選擇改良版的線栓法造成大鼠腦血管性病變后4周不予任何干預，待其自然癡呆的VD模型更好的模擬了現實生活中人腦血管病變后出現癡呆的病況，避免了一系列復雜因素的影響[10]。跳臺實驗與Morris水迷宮實驗是研究實驗室嚙齒類動物空間學習和記憶的常用方法[11]。本研究數據表明腦血管病變后隨著病程的延長，VD大鼠的空間學習及記憶能力也逐漸下降，導致認知障礙，與臨床VD患者不同階段出現的反應遲鈍、思維混亂、記憶模糊、智力障礙等癥狀表現類似[12]。

HPT軸的功能對中樞神經系統的發生、發展和正常功能的維持有重要的作用。研究表明，VD認知功能障礙的機制可能與海馬組織的病理性損傷相關，而下丘腦是否損傷的報道研究甚少[13]。本研究通過HE染色技術觀察大鼠下丘腦的病理形態，發現VD模型組大鼠下丘腦可見大片液化性壞死灶，小膠質細胞增生，大量炎癥細胞浸潤。臨床研究表明，VD患者發生腦梗死病灶侵及基底節區等部位可引起HPT軸功能紊亂，垂體反應性不佳致TSH分泌不足時，甲狀腺激素的合成及外周代謝發生障礙，血清中FT3、FT4顯著降低，代償性刺激TSH的分泌[14-16]。本課題組通過放射免疫法檢測HPT軸相關激素水平發現，VD可導致FT3、FT4的含量減少，TSH含量升高，與先前研究一致[17]。

VD屬中醫學“呆病”“健忘”等范疇[18]。課題組認為此病的病變部位在腦，多肝腎不足，中醫辨證多屬腎虛肝郁證型。頤腦解郁方由刺五加、郁金、梔子、五味子組成，方中刺五加、郁金二藥為君臣，兩者配伍既益氣補腎，填精益髓，又疏肝利膽，行氣解郁，腎氣足則腦髓漸充，肝氣達則郁氣自疏。梔子清解腦絡痰濁瘀毒，五味子澀精滋腎安神，又可防郁金、梔子苦寒清瀉過度，斂正氣而不斂邪氣，共為佐藥[19]。本課題組先前研究表明，頤腦解郁方可改善VD大鼠學習記憶能力，其作用機制可能與調節大鼠腦內單胺類遞質含量相關[20]。本次研究結果表明，頤腦解郁方可改善VD大鼠學習記憶能力，減輕下丘腦細胞變性、壞死程度，并能調節HPT軸的TSH、FT3、FT4含量。

綜上所述，頤腦解郁方對VD認知功能有改善作用，機制可能與調節HPT軸相關激素TSH、FT3、FT4含量有關。