基于網絡藥理學探討康婦炎膠囊治療盆腔炎的分子作用機制Δ

趙靜霞，高宏杰，貢磊磊，李 君

(1.中國中醫科學院西苑醫院麻醉科，北京 100091；2.中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700；3.首都醫科大學附屬北京婦產醫院藥事部，北京 100026)

盆腔炎(pelvic inflammatory disease，PID)是指女性上生殖道(子宮內膜、輸卵管、卵巢或盆腔腹膜)感染引起的炎癥，是一種具有嚴重生殖后遺癥的女性生殖道疾病[1]。2013—2014年美國國家健康與營養調查結果顯示，250萬18～44歲女性獲得過PID診斷[2]；2004年，由北京大學第一醫院牽頭組織的全國14家醫院的調查結果顯示，婦科門診就診患者中，PID患病率約為10.1%[3]。PID是育齡女性的常見病、多發病，若未得到及時、積極、正確診療，可引起輸卵管囊腫、肝周圍炎等近期后遺癥和不孕癥、異位妊娠、慢性盆腔炎及PID反復發作等遠期后遺癥，嚴重影響女性健康及生活質量，增加家庭和社會負擔。PID的治療主要以廣譜、經驗性抗菌藥物治療為主，必要時進行手術治療[4-6]。但臨床上在治療PID時，存在抗菌藥物應用不當、治療療程不夠以及濫用抗菌藥物等問題，使得常規西醫治療存在一定的局限性。中藥治療PID療效確切、不良反應小，具有獨特的優勢[7]。

根據臨床表現，PID屬于中醫學中“熱入血室”“婦人腹痛”及“帶下病”等范疇，其病機為濕熱之邪趁虛入體，與沖任之氣血相搏，瘀滯胞宮，或積郁肝經，致氣滯血瘀，久則成癥，而瘀阻沖任胞脈，不通則痛[8]。康婦炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術、當歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草11味中藥組成的復方制劑，具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，針對PID，藥證相符，臨床療效確切[7]。梁旭東等[9]的研究納入了438例PID患者，隨機觀察不同治療方案的療效，發現康婦炎膠囊聯合抗菌藥物治療PID的療效顯著，且安全可靠。蔡競等[10]發現，康婦炎膠囊可通過下調PID兔前炎癥細胞因子[白細胞介素(IL)8]和腹腔粘連相關細胞因子轉化生長因子β(TGF-β)的表達，并提高抗炎因子(IL-4、IL-10)的表達，調整致炎和抗炎的動態平衡，促使PID性疾病的康復。何延浩等[11]建立了大鼠PID后遺癥模型，發現康婦炎膠囊能夠減輕PID模型大鼠的子宮炎癥，提高模型大鼠的臟器指數及腹腔巨噬細胞的吞噬功能，調整大鼠機體免疫能力，從而改善大鼠PID后遺癥。目前，關于康婦炎膠囊治療PID多集中于臨床及藥效學研究，其治療PID的分子機制尚無文獻報道。本研究運用網絡藥理學方法預測康婦炎膠囊治療PID的活性成分及其作用靶點，為進一步的體內試驗和臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 康婦炎膠囊化學成分來源

基于中藥分子機制生物信息學分析工具(bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數據庫，分別檢索蒲公英、敗醬草、薏苡仁、赤芍、蒼術、當歸、川芎、香附、延胡索、澤瀉和白花蛇舌草等11味中藥的所有化學成分，建立康婦炎膠囊化學成分庫。

1.2 康婦炎膠囊靶標預測和PID靶標收集

基于BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數據庫，收集11味中藥化學成分潛在的靶點，合并所有靶點并去重，建立康婦炎膠囊候選靶標庫。在人類孟德爾遺傳綜合數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)中，以“pelvic inflammatory disease”“pelvic infection”為關鍵詞，對PID疾病靶標進行檢測，對收集的靶標去重，采用DAVID 6.7數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對靶點進行標準化，建立PID靶標庫。

1.3 康婦炎膠囊藥物靶標與PID靶標核心網絡構建、核心靶標功能及通路分析

基于String 10.5數據庫(http://string-db.org)，提取康婦炎膠囊候選靶標與PID相關靶標相互作用信息，設置蛋白種類為“homo sapines”，最高置信度參數評分>0.4，其他參數不變。對參數“degree”“betweenness”和“neighborhood”進行分析，取值方式為“degree”>中位數，進一步計算“betweenness”和“neighborhood”，取滿足3個拓撲結構特征值均>中位數的節點的靶標與其相互作用關系導入Cytoscape 3.5.1軟件構建康婦炎膠囊成分靶標及PID靶標核心網絡，并將這些核心靶標導入DAVIA 6.7數據庫，采用基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析(http://www.genome.jp/kegg/)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析(http://www.geneontology.org http://www.genome.jp/kegg/)分別對核心網絡靶標進行分析。

2 結果

2.1 康婦炎膠囊化學成分及其靶標預測

經過BATMAN-TCM數據庫，篩選整理獲得康婦炎膠囊中11味中藥的化學成分共249個，預測靶標1 594個，其中蒲公英化學成分4個，預測靶標89個；敗醬草化學成分17個，預測靶標265個；薏苡仁化學成分3個，預測靶標48個；赤芍化學成分9個，預測靶標50個；蒼術化學成分15個，預測靶標314個；當歸81個成分，預測靶標1 185個；川芎84個，預測靶標946個；香附12個，預測靶標450個；延胡索35個，預測靶標563個；澤瀉14個，預測靶標168個；白花蛇舌草4個，預測靶標165個。其中29個成分重復，這些藥物中的靶標之間有所重合(見表1)。蔡少青等[12]認為，中藥不同化學成分可通過相繼與靶標分子結合，形成疊加效應，共同發揮作用。對上述靶標合并去重后，共獲得1 594個靶標。

2.2 康婦炎膠囊治療PID核心靶標網絡分析

通過OMIM數據庫，收集PID相關靶標，經過DAVID數據庫標準化，去重后共獲得94個靶標。基于STRING數據庫中的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)數據庫，構建康婦炎膠囊潛在靶標與疾病靶標之間的相互作用網絡。根據“degree”>中位數為節點，以此為標準，篩選“degree”“betweenness centrality”和“neighborhood centrality”3個拓撲結構特征值均>中位數的節點為關鍵靶標網絡，根據以上條件篩選出關鍵靶標460個，根據“degree”顯示前150個靶標，見圖1。圖中，節點大小與“degree”呈正相關，其中康婦炎膠囊化學成分靶標143個，PID疾病靶標11個，藥物靶標和疾病靶標共4個。共有靶標有神經型一氧化氮合酶(NOS1)、CC趨化因子2(CCL2)、SRY相關高遷移率組蛋白9(Sox9)及前列腺素內過氧化物合酶(PTGS2)。NOS1是一氧化氮合酶3種亞型之一，也是炎癥的重要介質之一，研究結果表明，抑制NOS1可阻止AP1轉錄因子亞基的核異位，減弱炎癥基因的轉錄進而抑制炎癥反應[13]。CCL2是趨化因子中CC家族重要成員，也稱為單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，PID患者血漿中MCP-1表達顯著升高，血漿MCP-1濃度的評估可作為PID診斷的生物標志物[14]。此外，慢性非細菌性前列腺炎(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)相關臨床研究中發現，CPPS患者血漿中MCP-1水平明顯高于健康人，MCP-1可作為CPPS診斷的生物標志物[15]。SOX9作為腫瘤壞死因子α(TNF-α)的下游靶標，在牙髓炎和免疫反應中發揮著重要作用[16]。PTGS2也稱為環氧合酶2(COX2)，也是重要的炎癥介質，而COX2衍生的前列腺素是慢性前列腺炎和CPPS的重要治病因素[17]。

圖1 康婦炎膠囊治療PID核心靶標網絡圖Fig 1 Network diagram of core targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

2.3 康婦炎膠囊與PID核心靶標功能及通路分析

基于DAVID數據庫中GO和KEGG對150個藥物和疾病靶標進行功能和通路分析，對數據庫中富集的P值由小至大排序居前20位的生物學過程進行深入分析，以生物學過程為縱坐標，以基因比率為橫坐標構建氣泡圖，結果見圖2(A)。這些核心靶標主要富集于ERK1和ERK2級聯的正向調控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正向調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎癥反應(inflammatory response)、蛋白激酶B信號轉導(protein kinase B signaling)以及脂多糖介導的信號通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)等生物學過程。

此外，同樣對KEGG通路中P值由小到大排序居前20位的通路進行分析，以KEGG通路為縱坐標，以基因比率為橫坐標構建氣泡圖，結果見圖2(B)。可見，150個核心靶標主要富集于查加斯病(美國錐蟲病)[Chagas disease (American trypanosomiasis)]、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)以及T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)。

2.4 康婦炎膠囊治療PID的多維網絡分析

以KEGG通路富集分子中P值由小至大排序居前20位的通路制作中藥-成分-靶標-通路多維網絡分析，涉及11味藥物的164個成分以及107個靶標，見圖3。蒲公英中主要含有蒲公英甾醇、酚類和多糖類成分等，上述成分具有抗炎和抗菌作用，如蒲公英甾醇和蒲公英皂苷對脂多糖誘導的炎癥有顯著的抑制作用，其作用機制可能是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子κB(NF-κB)通路發揮抗炎作用[18-20]。敗醬草中富含黃酮、甾體、皂苷和鞣質等成分，其中白花敗醬醇具有較強的抗炎作用[21]。白芍中的芍藥苷可抑制炎癥因子TNF-α、Il-1β和iNOS的分泌，降低IκB磷酸化，通過抑制NF-κB的核轉位改善炎癥[22]。當歸中的當歸揮發油能夠改善LPS誘導炎癥模型[23]。川芎中的洋川芎內酯、A,Z-藁本內酯、新蛇床內酯和Z-藁本內酯可能通過COX-2、細胞外調節蛋白激酶2(ERK2)、蛋白激酶C(PKC)、Janus激酶1(JAK1)、JAK2、JAK3及NF-кB抑制蛋白激酶β(IKKβ)、TNF-α，阻礙炎癥信號傳遞[24]。香附中的Alpha-Cyperone同樣能夠抑制LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子COX-2和IL-6，其作用機制可能通過調控NF-κB有關[25]。延胡索中的黃連堿、小檗堿、巴馬汀、二氫血根堿和去氫紫堇堿可通過影響PI3K、JAK、PKC、ERK、IKKβ及TNF-α所在信號通路發揮抗炎作用[26]。澤瀉中的澤瀉總三萜具有良好的抗炎作用[27]。白花蛇舌草也是治療PID的佳品[28]。康婦炎膠囊中11味藥材所含的成分可能通過影響TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路和T細胞受體信號通路等通路中的靶標IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1、PTGS2、CCL2及NOS3改善炎癥反應。

A.GO功能富集分析；B.KEGG通路富集分析A.GO functional enrichment analysis;B.KEGG pathway enrichment analysis圖2 康婦炎膠囊治療PID關鍵靶標基因功能分析Fig 2 Gene function analysis on key targets of Kangfuyan capsules in the treatment of PID

圖3 康婦炎膠囊“藥材-成分-靶標-通路”網絡圖Fig 3 Network diagram of “herb-compounds-target-pathway”of Kangfuyan capsule

3 討論

PID多因產后、剖宮產后、流產后以及婦科手術后細菌進入創面感染而致，近年來，多由下生殖道的性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STD)上行感染至上生殖道而造成。PID多數以疼痛為主要表現。目前，單用抗菌藥物治療的用藥時間長，日后容易遷延，而配合清熱解毒、理氣活血的中藥口服治療，可提高PID的治愈率。此外，PID后遺癥有組織破壞、粘連、增生及瘢痕。采用中醫活血化瘀的方法治療，有助于恢復破壞組織、松解粘連、緩解增生及瘢痕形成。中藥復方制劑康婦炎膠囊具有清熱解毒、化瘀行滯和除濕止帶的功效，能夠有效治療PID和緩解PID后遺癥。但其作用機制尚未闡明，本研究采用網絡藥理學方法，結合國內外專業數據平臺和分析軟件，分析了康婦炎膠囊治療PID的潛在靶標，并對關鍵靶標進行了生物信息學分析，構建了康婦炎膠囊治療PID的多維網絡圖。

康婦炎膠囊是由蒲公英、敗醬草、薏苡仁及赤芍等11味中藥組成，通過相關數據獲得249種成分，上述成分潛在的靶標有1 594個，其中一些成分可能是康婦炎膠囊中的質量標志物，通過與相應靶標相結合發揮抗炎作用，從而改善PID及其后遺癥[29]。PID疾病靶標收集結果顯示，PID發病機制中94個靶標可能通過直接或間接作用影響PID的發生發展過程。中藥的化學實體與生命體分子網絡的交互作用是中藥治療疾病的重要方式[30]。在這些藥物靶標和疾病靶標中，NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標是藥物和疾病共有靶標，這4個靶標均為炎癥的重要介質，在PID或炎癥性疾病中發揮重要作用，因此，其可能在康婦炎膠囊治療PID中發揮主導作用。進一步的生物信息學分析結果顯示，藥物和疾病組成的核心靶標參與了炎癥反應、LPS介導的信號通路、ERK1和ERK2級聯的正向調控、PI3K信號的正向調控等生物學過程，其中LPS通過識別細胞膜上的TLR4受體誘發炎癥反應過程[31]。此外，這些核心靶標參與TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路及T細胞受體信號通路等炎癥信號通路，表明康婦炎膠囊可能通過干預上述通路中的核心靶標參與了PID及其后遺癥的治療。中藥-成分-靶標-通路分析結果顯示，康婦炎膠囊中的成分不僅可以通過影響NOS1、CCL2、Sox9和PTGS2靶標發揮藥效，還可以通過干預TNF信號通路、趨化因子信號通路及T細胞受體信號通路等通路中的IL-6、MAPK14、TNF、NF-κB1及NOS3等靶標參與PID的治療過程。

本研究通過網絡藥理學方法，建立了康婦炎膠囊中11味中藥的中藥-成分-靶標(藥物和疾病)-通路網絡，顯示了中藥多成分與靶標之間的關聯，并且明確了康婦炎膠囊藥效物質及其發揮治療PID的分子機制，為康婦炎膠囊治療PID及其后遺癥提供了臨床依據，也為進一步的體內外試驗提供了重要參考。