微小RNA對顱頜面骨改建調控的研究進展

王一軒?孫智雯?麥志輝

【摘要】微小RNA（miRNA）在顱頜面骨缺損修復的調控中起重要作用。近年來多項研究表明miRNA可以通過直接或間接作用參與骨的修復與改建。機械力刺激、通路調節、炎性因子等多種因素使miRNA在顱頜面骨改建中的調控復雜多樣。該文概述了miRNA在顱頜面骨改建中的作用機制，并從機械力刺激、通路調節及炎性因子3個方面對其在顱頜面骨改建過程中的調控進行綜述。

【關鍵詞】微小RNA;骨改建;顱頜面骨;機械力學;通路調節;炎性因子

Research progress on the role of microRNA in regulating cranio-maxillofacial bone remodeling Wang Yixuan， Sun Zhiwen， Mai Zhihui. Department of Orthodontics， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Uni- versity， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Mai Zhihui， E-mail： maiya2007@ 126. com

【Abstract】MicroRNA （miRNA） plays an important role in regulating the repairing of cranio-maxillofacial bone defects. Recent studies have shown that miRNAs participate in bone repairing and remodeling through direct or indirect effect. Mechanical force， pathway regulation， inflammatory cytokines and other factors enhance the complexity and diversity of the regulation of miRNA cranio-maxillofacial bone remodeling. In this article， the mechanism underlying the role miRNA in cranio-maxillofacial bone remodeling was summarized， and its regulation in cranio-maxillofacial bone remodeling was reviewed from three aspects of mechanical stimulation， pathway regulation and inflammatory cytokines.

【Key words】MicroRNA;Bone remodeling;Cranio-maxillofacial bone;Mechanical force;

Pathway regulation;Inflammatory cytokine

《中國衛生和健康統計年鑒2019》顯示，2018年我國骨類疾病相關的門診治療人次達1569.24萬人次，相比2013年總診療人次增加了300多萬。而2018年公立醫院出院病人中僅顱頜面骨骨折出院的患者數量就高達168 449人次，占同年因骨折出院人數的27.75%[1]。雖然骨缺損修復的需求逐年增加，且已發現多種影響骨改建的因素，但顱頜面骨缺損修復的相關機制仍未完全闡明[2-4]。

近年來，微小RNA（miRNA）在骨改建調控領域中展現出巨大的研究價值。miRNA是經過Diecer酶加工后的終末產物。它從初級轉錄產物miRNA （pri-miRNA）通過形態學的改變，并被Diecer酶剪裁后形成成熟的非編碼小RNA分子。盡管miRNA調控骨改建的作用機制尚未明晰，但已有多項研究表明miRNA可以促進骨缺損修復[5-8]。本文主要從機械力刺激、通路調節以及炎癥因子3個方面對miRNA在顱頜面骨改建中的調控展開綜述。

一、miRNA在顱頜面骨改建調控中的作用機制

miRNA在細胞增殖、分化和凋亡等多種生命活動中發揮重要調控作用，因此它在研究真核生物的基因表達和功能調控中有重要意義。研究顯示miRNA的作用部位在其種子序列上5端第2 ～ 8位核苷酸，它識別目標基因mRNA上3端的結合位點，并攜帶RNA蛋白復合物與mRNA結合。miRNA的作用機制包括與靶基因部分結合以抑制靶基因翻譯，和靶基因完全結合切斷靶基因的mRNA使其降解，或結合以上兩種情況，通過與mRNA完全或部分堿基互補配對，降解或抑制翻譯，達到干擾靶基因翻譯和表達的作用[5]。

顱頜面骨是支持性結締組織，具有一定的硬度和彈性。顱頜面骨組織在生長發育及損傷修復等刺激下，骨性微環境發生改變，在各種因素調控下產生成骨細胞和破骨細胞的動態變化，從而達到新的微環境平衡。

miRNA在顱頜面骨改建的調控作用主要存在于骨代謝中各細胞因子的增殖分化。顱頜面骨在骨發育和骨代謝中，根據各部分組織來源不同（如額骨來源于神經嵴，頂骨來源于中胚層），miRNA的分布也不同，其不僅參與骨重塑，而且通過影響成骨或破骨細胞等的增殖、分化和凋亡進一步調控骨改建[9]。由于骨細胞具有應力感知及信號傳遞的樞紐作用，在細胞內外微環境改變時，不同miRNA參與調控骨細胞信號傳遞的效果不同，因此，miRNA在骨骼系統的調控通常是多因素、多通路的。

二、影響miRNA在顱頜面骨改建調控的相關因素

1.機械力刺激

骨組織改建的始動因素之一是機械力刺激。適當的機械力刺激可以調控骨改建以維持骨骼內礦物質的合理比重，而不當的機械力刺激，則可造成骨吸收，細胞異常增殖等。

不同miRNA有不同的生物學特性，有的miRNA具有機械力敏感性。Wu等[10]通過對牙周膜細胞（PDLC）的體外力學加載模型進行高通量測序，得出拉伸狀態PDLC的miRNA表達譜。他們通過生物信息學分析發現，在拉伸和非拉伸不同的外力刺激狀態下，PDLC中共有47個miRNA出現差異表達，并檢測出9種與骨改建相關的miRNA（miR-221-3p、miR-138-5p、miR-132-3p、miR-218-5p、miR-133a-3p、miR-145-3p、miR-143-5p、miR-486-3p和miR-21-3p）。

在機械力作用下，miRNA可通過調控細胞的增殖、分化和凋亡進而調控骨改建。Li等[11]采用miR-21基因缺陷小鼠和野生型小鼠建立顎縫擴張動物模型，并體外培養了來自miR-21基因缺陷小鼠和野生型小鼠的骨髓間充質干細胞（BMSC）發現除了第28 d，miR-21基因缺陷小鼠顎縫擴展程度減小，骨縫愈合時間延長，同時堿性磷酸酶及骨鈣素含量均減少。進一步研究發現在機械力作用下，缺乏miR-21會破壞骨膜細胞正常增殖，正向調節破骨細胞生成，降低骨保護素的含量，促進核因子-κB（NF-κB）受體活化因子配體的表達，從而提高骨吸收速率，降低骨形成速率。缺少miR-21不但導致骨膜細胞增殖能力下降，而且抑制骨細胞的遷移能力。Sun等[12]在體外細胞實驗中發現機械力負載環境下，miR-181c-5p可以直接抑制cyclin B1蛋白的翻譯，將成骨細胞分化阻滯在G期，使之無法正常增殖，造成成骨細胞的異常增殖，影響骨生成速率。

機械力負載環境下，Wang等[13]在體外實驗中發現miR-33-5p不能影響細胞增殖，但可以直接靶向Hmga2抑制蛋白促進成骨細胞分化。在小鼠動物實驗中也證明了機械力環境下miR-33-5p可正向調控成骨細胞分化，減弱部分抑制成骨分化的途徑。機械力卸載會導致關節、脊柱等負重部位的受力改變，可引起骨丟失，常發生在臥床制動、太空失重等環境下。Zhang等[14]在體外細胞實驗中發現除miR-30a外的miR-30家族在MC3T3-E1細胞卸載條件下表達上調;在機械力卸載環境下，miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e靶向Runx2的表達顯著增加，并與Runx2的表達呈負相關;進一步研究發現，這4種miRNA能抑制Runx2的表達和成骨細胞的分化，當敲除這些miRNA可以減弱機械力卸載對MC3T3-E1細胞成骨分化的抑制作用。

模擬微重力條件下，Wang等[15]在MC3T3-E1細胞中發現miR-139-3p和lncRNA-ODSM通過競爭作用調節成骨細胞的分化和凋亡，其中miR-139-3p靶向ELK1抑制分化并促進成骨細胞凋亡。

2.通路調節

miRNA對顱頜面骨改建的調控受多通路影響。研究表明miRNA可以通過骨形態發生蛋白（BMPs）信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等進行調節，不同通路調節共同作用體現了miRNA調控骨改建因素的多通路性。

2.1 BMPs信號通路

BMPs大部分屬于轉化生長因子-β（TGF-β）超家族，miRNA通過BMPs激活BMPs/Smad 等相關BMPs信號通路，調節骨改建，是骨改建調控中的重要途徑[16]。BMPs/Smad信號通路是通過BMPs與細胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體BMPs特異性結合激活I型受體（BMPR1），再與細胞內的Smad分子作用，如Smad1、Smad5和Smad8等，轉移到細胞核內以調節下游基因的表達[17]。

Li等[18]利用Cre/loxP的桿狀病毒載體，在人脂肪來源干細胞（hASC）中過表達BMP-2和miR-148b，發現過表達BMP-2會激活BMPs拮抗劑noggin表達，而miR-148b抑制noggin表達，從而緩解BMP2誘導成骨分化的負向調控，在不影響HASC增殖及Cre/loxP桿狀病毒的安全毒性范圍內，上調了HASC的成骨。當把共表達BMP-2和miR-148b的hASC植入裸鼠體內，發現在移植后12周對臨界大小的顱骨缺損（直徑4 mm）產生明顯修復，填充骨缺損區域的83%，新生骨是原有缺損的75%的骨體積，并將骨密度恢復到原始骨密度的89%。該研究表明，基于Cre/loxP的桿狀病毒介導的BMP-2/miR-148b表達有可能用于顱頜面骨缺損修復修復。

Akkouch等[19]在細胞實驗、大鼠的顱骨缺損模型中證實了miR-200c通過直接靶向noggin正向調控BMPs通路，增強成骨分化，同時抑制Wnt通路拮抗劑Klf4和Sox2的表達，間接提高Wnt信號轉導活性。在miR-200c作用下，BMPs通路與Wnt通路協同作用，促進成骨細胞的分化和頜面骨的再生。

2.2 Wnt/β-catenin通路

骨修復是一個復雜的動態過程，Wnt/β- catenin信號通路是骨修復鄰域最關鍵的信號通路之一，對胚胎發育過程中的形態發生和細胞組織具有重要的作用。該系統通常在成年時被抑制，但在器官損傷和再生過程中可以被重新激活，受到嚴格調控。

骨修復的過程需要血管神經營養支持，當骨改建區域神經支配不足時，會影響改建的速度。阿司匹林常被用作NSAID，治療中度疼痛、炎癥和心血管疾病。Lei等[20]在大鼠下頜骨缺損模型中發現，miR-222聯合阿司匹林的混合物，可以在阿司匹林糾正骨缺損區域炎癥環境下，通過miR-222激活Wnt/β-catenin/Nemo-like激酶信號通路誘導人BMSC分化為神經樣細胞，在大鼠下頜骨缺損區注射搭載二者的水凝膠可促進骨改建區域新骨形成。

Liu等[21]在檢測去卵巢組、假手術組、miR-141激動劑組和miR-141拮抗組大鼠頜骨骨密度和病理改變中發現miR-141過表達可通過激活Wnt/β-catenin途徑抑制去卵巢大鼠頜骨骨質疏松。Sui等[22]在體外細胞學實驗證明miR-335-5p通過下調Wnt拮抗劑Dickkopf-1來促進成骨分化，并利用納米材料將miR-335-5p導入成骨細胞，通過脂類傳遞miRNA可以誘導干細胞成骨分化和骨再生，促進體外成骨和小鼠體內顱骨愈合，結果顯示顱骨缺損修復明顯。

3.炎性因子

miRNA在炎性因子作用下進行骨改建的調控根據結合情況可分兩種，包括直接與炎癥因子結合調控骨改建，和在炎癥微環境作用下激活其他細胞因子進行間接調控。顱頜面骨炎癥微環境在牙周病患者中普遍存在。牙周病是全球公認的常見疾病，可導致牙周纖維束的降解和牙槽骨骨質流失，造成牙松動脫落，使患者生活質量降低。形成新骨被認為是治療牙周病最有效的方法之一，但現有的研究仍未完全闡明炎性微環境的骨改建機制，因此對牙周病的治療也相對有限[23]。多項研究表明，miRNA在炎癥環境中對新骨形成具有調節作用[23-24]。Gon?alves Fernandes等[25]研究發現，與牙周健康的受試者相比，患有局部侵襲性牙周炎（LAP）的患者在TLR4和TLR2結合后產生的促炎細胞有6種以上miRNA存在顯著差異，LAP中miR-9-5p、miR-155-5p、203a-3p、miR-147a、miR-182-5p和miR-183-5p等miRNA表達顯著上調。多數基因與miRNA的過度表達和炎癥反應有直接或間接的關系。

3.1 TNF-α

TNF-α可以促進炎癥以及腫瘤的發展，在細胞各種病理生理狀態中進行免疫調節。Zou等[26]通過體外細胞實驗以及構建小鼠模型發現，低濃度（0.01 ～ 0.1 ng/ml）? 的TNF-α可促進miR-21的表達，高濃度（1 ～ 10 ng/ml）的TNF-α可抑制miR-21的表達和成骨活性。不同TNF-α濃度下，miR-21通過激活JAK2/STAT3通路，調控炎癥下的骨改建，表明miR-21在炎癥狀態下具有調控能力，并且這種調控能力與炎癥因子的濃度相關。Ohnuma等[27]在體外細胞實驗證明miR-124抑制TNF-α和IL-6誘導的破骨細胞分化。

3.2 IL-6

IL-6是一種多功能細胞因子。IL-6在啟動免疫應答中具有重要作用，與慢性炎癥微環境有關，具有免疫調節功能，并在機體病理生理中都起重要作用。Wang等[28]在體外細胞實驗及小鼠實驗中發現，miR-181b-5p通過靶向成牙骨質細胞中的IL-6來調節TNF-α誘導的炎癥反應。在TNF-α刺激的OCCM30成骨細胞中，過表達miR-181b-5p可負性調節IL-6并導致相應成骨細胞凋亡，使處于炎癥微環境中的成骨細胞無法進行病理反應，減少TNF-α產生，在小鼠模擬成牙骨質細胞的炎癥環境下，過表達miR-181b-5p可負性調節IL-6。蛋白免疫印跡法分析和熒光素酶活性報告基因檢測表明，miR-181b-5p降低NF-κB的活性。因此，miR-181b-5p通過靶向IL-6，在成牙本質細胞中調節促炎趨化因子的產生，并參與NF-κB信號轉導。此外，miR-181b-5p可促進成牙本質細胞凋亡，促進炎癥消退。

Lian等[29]在高表達miR-335-5p（335-TG）轉基因小鼠上建立實驗性牙周炎（EP）模型，通過實施定量PCR檢測炎癥和破骨細胞基因表達，及顯微計算機斷層掃描（μCT）對牙槽骨形態進行分析發現，與WT-EP組相比，μCT分析顯示335-TG-EP組骨質丟失較少，IL-6的表達明顯降低，同時TRAP陽性破骨細胞數量減少，HE染色法和免疫組織化學染色法顯示335-TG-EP組炎癥減輕。

三、總結與展望

miRNA在顱頜面骨組織改建過程中的調控具有多樣性。近年來的研究表明，miRNA在機械力刺激下通過調節細胞的增殖、分化和凋亡來調控骨改建。通過譬如BMP或Wnt等不同信號通路進行協作調控，加強了miRNA在調控骨改建中各因子間聯系。炎癥微環境下，miRNA與炎性因子作用，進而調控骨改建。因此，對miRNA在骨改建調控中的研究需要結合多因素共同考慮。同時，對miRNA的研究也從微觀角度補充了骨改建調控的分子機制，為臨床顱頜面骨改建及缺損修復提供參考依據。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-12-10）

（本文編輯：鄭巧蘭）