黃瓜新品種‘科潤99’種子純度SSR 鑒定

趙海燕 劉 楠 房文文 杜勝利 崔洪宇

（天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所/蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室 天津300192）

黃瓜（Cucumis sativus L.）為葫蘆科黃瓜屬植物，在我國被廣泛種植，是大眾餐桌上的主要蔬菜之一。黃瓜種子品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著黃瓜的品質(zhì)與產(chǎn)量[1-3]。 黃瓜種子的純度通常受制種基地隔離措施、制種戶對制種規(guī)程的執(zhí)行力等綜合因素的共同影響。隨著我國黃瓜種業(yè)市場化程度日益提高，使得快速、有效地鑒別雙親、混雜品種和真實雜交種成為必然。以往常規(guī)的田間純度鑒定主要是形態(tài)鑒定法， 很大程度上依賴于育種家對種子、幼苗、成年植株、葉、花、花粉、果實等器官的顏色、刺瘤、瓜把等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀察指標，該方法的優(yōu)點是簡單、方便、直觀，但鑒定周期長、工作量大，容易受季節(jié)、栽培措施及環(huán)境因素的限制，往往準確度欠佳。 品種的純度和真?zhèn)舞b定本質(zhì)上是對其基因型的鑒定, 田間形態(tài)學鑒定尤其是對親緣關(guān)系較近的品種往往很難區(qū)分， 而且有的新品種本身就缺乏可供鑒定的新農(nóng)藝性狀，另外還要求鑒定者對品種的特征非常熟悉，具有一定的工作經(jīng)驗。 上述的諸多問題均可能影響后期品種純度鑒定的準確程度， 進而也給后期良種的推廣使用造成影響， 因此采用更為合理高效的檢測方法十分必要[1,4-6]。

隨著DNA 分子標記技術(shù)的出現(xiàn)，使品種純度鑒定有了良好的技術(shù)平臺和更為適合的技術(shù)手段。DNA 在生物體各組織、各發(fā)育階段均可檢測到，并且可以在種子發(fā)育后的各個時期、各個階段采集樣本，因此其具有標記可遍布整個基因組、無組織特異性、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點， 而且其遺傳穩(wěn)定性好。SSR 標記，即簡單序列重復，具有數(shù)量豐富、在基因組中分布均勻、多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復性好、操作簡單、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，同時又因SSR 引物共顯性的特點在雜交種純度鑒定具有獨特優(yōu)勢[1]，非常適合于高通量分析[5,7]。SSR 分子標記已經(jīng)大規(guī)模的成熟應用于黃瓜品種純度鑒定， 同時也已廣泛應用于茄子[8-9]、油菜[10]、甘藍[11]、甜瓜[7]等蔬菜作物雜交種純度鑒定中。

本文作者利用SSR 標記對天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所育成的黃瓜新品種‘科潤99’及其父、母本的種子純度進行鑒定，旨在為‘科潤99’種子純度鑒定提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘科潤99’黃瓜雜交種及其父、母本，由天津科潤黃瓜研究所生物技術(shù)室提供。

1.2 DNA 提取

本試驗采用CTAB 法提取黃瓜基因組DNA，方法同崔興華等（2015）。

1.3 特異引物篩選

以上述提取的DNA 為模板， 165 對引物進行PCR 擴增， 選取父本、 母本、 F1各 2 粒， 擴增產(chǎn)物經(jīng)8% PAGE 凝膠電泳、 染色、 顯色后進行分析，依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置進行試驗分析。 試驗結(jié)果中選取雜交種和父母本間存在共顯性分離的引物， 對比分析從而應用于該品種的純度檢測。

PCR 采用 10 μL 擴增體系： 模板 DNA10 ng、上游引物和下游引物各25 ng、2×Taq PCR Master Mix（包含 Taq、Buffer、Mg2+、dNTP）5.0 μL，3.96 μL 滅菌去離子水。

擴增程序：95℃預變性 300 s，95℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 60 s，32 個循環(huán)；72℃再延伸350 s。

1.4 特異引物的驗證

試驗時間為2019 年4～12 月。 在試驗田中隨機選取220 株‘科潤99’黃瓜植株進行田間生物學性狀觀察， 同時于實驗室中提取對應植株的DNA 進行SSR 擴增， 將田間純度鑒定結(jié)果與SSR 分子標記純度鑒定結(jié)果進行對比分析， 從而驗證篩選到的引物對‘科潤99’種子純度鑒定的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘科潤99’特異引物篩選

選用165 對 SSR 引物在‘科潤 99’及父、母本間進行特異譜帶的篩選，通過PCR 擴增及電泳分離，有10 對引物在親本間表現(xiàn)為共顯性分離（圖1），‘科潤99’表現(xiàn)為雙親互補帶型。

圖1 科潤99 部分引物篩選圖譜

2.2 ‘科潤99’特異引物純度鑒定的驗證

將初步篩選出的10 對SSR 引物，再次對田間所栽培的220 株 ‘科潤99’ 黃瓜植株進行SSR 純度鑒定，觀察試驗結(jié)果，從而對所選出的引物是否可以鑒定 ‘科潤99’種子純度進行評估、驗證。 試驗結(jié)果表明（附表、圖2、圖3），10 對引物的擴增產(chǎn)物的電泳譜帶中‘科潤99’的條帶均為父、母本互補帶型，與上述篩選結(jié)果表現(xiàn)一致。 其中引物N216 和N221 不純種子的檢出率分別為2.27%和1.82%，田間鑒定不純率為2.73%， 二者純合種子的符合率在99.0%以上，并且這兩對引物擴增的條帶清晰、 帶型整齊， 特異性強。由此可見，這兩對SSR 標記可以作為‘科潤99’種子純度鑒定的特異分子標記，從而用于純度檢測。 同時也表明在SSR 分子標記技術(shù)結(jié)果的可靠性、 準確性，決定其可以對黃瓜品種進行純度鑒定。

圖2 引物N216 對科潤99 及其親本擴增圖譜

圖3 引物N221 對科潤99 及其親本擴增圖譜

附表 SSR 分子標記鑒定與田間鑒定比較

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果顯示，165 對SSR 引物中篩選出在 ‘科潤99’ 的親本間表現(xiàn)較好的多態(tài)性的引物有10 對。其中N216 和N221 這兩對引物在試驗中表現(xiàn)更為優(yōu)秀，試驗結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進行對比發(fā)現(xiàn)，這兩對SSR 引物與田間純度鑒定結(jié)果高度吻合，二者符合率在 99.0%以上。 因此，SSR 標記 N216 和 N221 的室內(nèi)分子檢測方法可以應用于替代田間‘科潤99’黃瓜種子的純度鑒定，成功的解決了田間鑒定周期長、容易受環(huán)境條件等影響的問題，同時也降低了財力、物力和人力消耗。

近年來天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所已將SSR 技術(shù)熟練地應用于本單位多個黃瓜雜交種的純度鑒定， 從而保證本公司的產(chǎn)品可以及時的投入市場。 每一個品種在基因型上都是非常穩(wěn)定的， 以此為基礎(chǔ)即可使用SSR 分子標記技術(shù)檢測出某些位點的純度， 當某一品種種子中混入其親本自交種或其他品種種子時，SSR 分子標記通過檢測該樣品植株間基因型的差異，即可分辨出來。 通常對于母本自交的種子，可以采用單引物檢測方法，即可把其雜交種和其父母本雜株區(qū)別開來。 但如果檢測樣品存在異源花粉的F1或機械混雜種子時， 即需要采用多對SSR 引物同時對該樣品進行檢測， 從而提高檢測結(jié)果的準確程度。