益氣活血軟堅(jiān)解毒方聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)H-22肝癌細(xì)胞的增效減毒作用

★ 張旼旼 黃新宇 戴慧（杭州市腫瘤醫(yī)院 杭州 310002）

原發(fā)性肝癌（簡(jiǎn)稱肝癌）其中90 %為肝細(xì)胞肝癌，是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第六位，死亡率居第四位［1］。由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者初診時(shí)常為中晚期，已失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。以?shī)W沙利鉑（OXA）為主的全身治療是治療肝癌的主要手段之一［2］。但OXA在化療過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)毒性、惡心嘔吐、骨髓抑制、肝功能改變、免疫功能下降等不良毒性反應(yīng)，加上晚期患者體力狀況評(píng)分低下，常導(dǎo)致患者化療不能耐受，致使化療周期延長(zhǎng)或者化療藥物減量。益氣活血軟堅(jiān)解毒方（YHRJ）是在歸納古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)，結(jié)合幾十年臨床經(jīng)驗(yàn)主要用于肝癌患者的成熟方劑，研究已證實(shí)，YHRJ可以抑制肝癌的生長(zhǎng)，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期［3］。本文以肝癌細(xì)胞H-22為研究對(duì)象，初步探討YHRJ對(duì)OXA的增效減毒作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、瘤株與藥物 BALB/c小鼠：體質(zhì)量18～22 g，4周齡，雌雄各半，小鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50 %～60 %，光照每12 h明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h。瘤株：H-22肝癌細(xì)胞,由賽百慷提供，貨號(hào)：HEPA1-6。藥物：益氣活血軟堅(jiān)解毒方（YHRJ）組成：生黃芪30 g、炒白術(shù)15 g、田三七8 g、水紅花子8 g、藤梨根30 g、凌霄花9 g、炮山甲10 g、白花蛇舌草30 g、半枝蓮30 g，常規(guī)水提取，回流濃縮成浸膏，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成等效劑量YHRJ 3.4 g/mL、高劑量YHRJ 6.8 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩ｊ?yáng)性對(duì)照藥物OXA：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，用5 %葡萄糖液調(diào)配成1 g/L的溶液，遮光保存。

1.2 動(dòng)物模型制備與分組 取48只小鼠，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H～22肝癌細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL，頸部右側(cè)皮下接種0.2 mL，繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，2-3周后待腫瘤增殖至可以觸及時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：A 對(duì)照（NS）組；B 奧沙利鉑（OXA）組；C等效劑量YHRJ（EYHRJ）組；D等效劑量YHRJ+OXA（EYHRJ+OXA）組；E 高劑量YHRJ（HYHRJ）組；F高劑量YHRJ+OXA（HYHRJ+OXA）組。

1.3 用藥 NS組及YHRJ單藥組采用灌胃的給藥方法，每天分別給于0.9 % NaCl及YHRJ（EYHRJ濃度為3.4 g/mL，HYHRJ濃度為6.8 g/mL）各0.3 mL，1次/d，連續(xù)14 d；OXA組采用腹腔注射OXA（劑量為1.5 mg/kg，用5 %葡萄糖液調(diào)配成0.5 mL/鼠，1次/d）連續(xù)14 d；聯(lián)合組每天灌胃給予不同劑量的YHRJ 0.3 mL及腹腔注射OXA 0.5 mL，1次/d，連續(xù)14 d。

1.4 生化及流式的試劑

表1 主要材料

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 抑瘤率 每隔3 d觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（L）和寬徑（W），單位為毫米（mm）。2周后處死小鼠，腫瘤體積=（L×W2）/2；腫瘤抑瘤率=［（A-B）/A］×100 %。（A：對(duì)照組腫瘤體積，B：給藥組腫瘤體積）。聯(lián)合作用評(píng)價(jià) 采用金氏公式評(píng)價(jià)藥物的聯(lián)合作用。金氏公式：Q = E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。EA、EB分別表示A和B兩種藥物單獨(dú)用藥的效應(yīng)；E（A+B）表示藥物A和藥物B聯(lián)合用藥的效應(yīng)。如果Q＞0.85為兩藥具有相加作用，Q＜0.85為拮抗作用。

1.5.2 血常規(guī)計(jì)數(shù)及瑞士-吉姆薩染色 用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）的數(shù)值。取小鼠骨髓液，離心后棄去上清，用生理鹽水稀釋下層沉淀，涂于載玻片上，自然風(fēng)干，用瑞士-吉姆薩染液染色觀察骨髓有核細(xì)胞（BMC）。

1.5.3 YHRJ對(duì)小鼠肝臟功能的影響 采小鼠心臟血，離心分離血清，采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）。取小鼠肝臟組織，加生理鹽水制備成肝組織勻漿，離心后取上清液，用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶試劑盒測(cè)定肝臟中γ-谷氨酰肽轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）活性。

1.5.4 YHRJ對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響 小鼠取脾臟，裂解后離心獲取淋巴細(xì)胞液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

T細(xì)胞亞群的檢測(cè)：取100 μL淋巴細(xì)胞懸液，加入1 μL FITC抗小鼠CD3、0.5 μL PE抗小鼠CD4、0.5 μL APC抗小鼠CD8a熒光抗體，進(jìn)行細(xì)胞熒光染色40 min，設(shè)置單染及空白對(duì)照管；加入細(xì)胞洗滌液1.5 mL，振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入細(xì)胞保存液0.2 mL，振蕩流式檢測(cè)。

B細(xì)胞的檢測(cè)：取100 μL淋巴細(xì)胞懸液，加入單克隆抗體1 μL FITC抗小鼠CD3，1 μL APC抗小鼠CD19進(jìn)行細(xì)胞熒光染色40 min，設(shè)置單染以及空白對(duì)照管；加入細(xì)胞洗滌液1.5 mL，振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入細(xì)胞保存液0.2 mL，振蕩懸浮細(xì)胞，流式檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑瘤率

圖1 YHRJ對(duì)小鼠肝癌的抑制作用

表2 各組小鼠腫瘤終體積及抑瘤率（ ，n=8）

圖1、表2可見(jiàn)，給藥2周后，除EYHRJ組外，其它組各腫瘤大小較NS組均明顯減小（P＜0.05或P＜0.01）；兩聯(lián)合組的抑瘤率均達(dá)到35 %以上，兩聯(lián)合組腫瘤大小均小于OXA單藥組，其中，HYHRJ+OXA組較OXA單藥組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。根據(jù)金正均公式計(jì)算結(jié)果，EYHRJ、HYHRJ與OXA聯(lián)合均具有相加作用，表明YHRJ能夠增強(qiáng)OXA的抑瘤作用。

2.2 YHRJ對(duì)小鼠血常規(guī)、骨髓有核細(xì)胞的影響 較NS組，OXA單藥組中RBC、WBC、HGB、PLT和BMC的數(shù)目均減少，其它各給藥組中上述細(xì)胞數(shù)目均增多。其中，EYHRJ組中，除WBC外，其余細(xì)胞的數(shù)目較NS組增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。該結(jié)果提示在腫瘤的治療過(guò)程中，YHRJ可以保護(hù)RBC、HGB、PLT及BMC。較OXA單藥組，兩聯(lián)合組中RBC、BMC細(xì)胞數(shù)目均明顯升高，表明YHRJ尤其可以保護(hù)RBC、BMC，具有抵抗OXA化療引起的骨髓抑制作用（表3和圖2）。

圖2 小鼠骨髓有核細(xì)胞吉姆薩染色圖（400倍）

表3 各組小鼠血常規(guī)細(xì)胞、骨髓有核細(xì)胞數(shù)目變化（ ，n=8）

2.3 YHRJ對(duì)小鼠肝功能的影響 表4中可見(jiàn)，與NS組比較，OXA組中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值均顯著上升（P＜0.01），EYHRJ組、HYHRJ組中除ALT外，AST、ALP、γ-GT值均顯著下降（P＜0.01），表明YHRJ可以降低肝功能指標(biāo)，對(duì)肝功能具有保護(hù)作用;與OXA組比較，兩聯(lián)合組中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值也均顯著下降，提示YHRJ可減輕OXA引起的肝功能損害（P＜0.01）。

表4 YHRJ對(duì)小肝臟功能的影響（ ，n=8）

2.4 YHRJ對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的影響 與NS組比，OXA單藥組給藥后CD3+T細(xì)胞（右下象限）、CD3+CD4+T細(xì)胞（右上象限）、CD3+CD8+T細(xì)胞（右上象限）、CD3-CD19+B細(xì)胞（左上象限）均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；EYHRJ組、HYHRJ組上述各淋巴細(xì)胞均顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）；與OXA相比，EYHRJ+OXA組中除CD3+CD4+T細(xì)胞外，其余各淋巴細(xì)胞均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），HYHRJ+OXA組各淋巴細(xì)胞群較OXA組則無(wú)顯著差異（表5和圖3-4）。該結(jié)果表明，YHRJ具有保護(hù)免疫細(xì)胞的功效，EYHRJ可以顯著改善OXA化療引起的免疫功能低下。

表5 YHRJ對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞群的影響（ ，n=8） %

圖3 YHRJ對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞群的影響

圖4 YHRJ對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)在治療惡性腫瘤方面有著固本培元的優(yōu)勢(shì)，YHRJ是臨床常用的治療肝癌的中藥復(fù)方制劑，主要成份有生黃芪、炒白術(shù)、藤梨根、白花蛇舌草、半枝蓮、水紅花子、田三七、凌霄花、炮山甲等，其中，生黃芪、炒白術(shù)可扶正固本，藤梨根、白花蛇舌草能夠清熱解毒［4］，半枝蓮、水紅花子具有抗菌、激活增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能［5-7］，田三七、凌霄花主治活血化淤［8］，炮山甲具有去瘀散結(jié)的功效［9］。扶正固本、清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)是中醫(yī)藥治療癌癥的主要法則，且中藥復(fù)方制劑具有整體協(xié)同的作用，可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制血管生成、刺激免疫細(xì)胞、改善免疫功能等多個(gè)途徑控制腫瘤進(jìn)展。

本研究結(jié)果中，YHRJ對(duì)H-22肝癌細(xì)胞移植瘤具有一定抑制作用，當(dāng)與OXA聯(lián)合時(shí)，可增強(qiáng)其抑瘤作用，聯(lián)合用藥具有相加作用，抑瘤率可提高到35 %以上。YHRJ可回升造血細(xì)胞，尤其是紅細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞，改善肝功能，對(duì)OXA化療中引起的骨髓抑制、肝功能改變具有顯著的保護(hù)作用。YHRJ還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，提高免疫功能。晚期肝癌的患者由于體力狀況不佳，免疫功能低下，往往不能耐受兩藥或者三藥方案的聯(lián)合化療。YHRJ具有抑制腫瘤增殖、保護(hù)骨髓造血細(xì)胞、改善肝功能、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，與化療藥聯(lián)合，發(fā)揮其增效減毒的作用，為晚期肝癌的治療帶來(lái)新的思路和方法。在臨床使用時(shí)，可按照藥物在動(dòng)物與人體間劑量換算原則來(lái)計(jì)算出適應(yīng)人體的合適聯(lián)合用藥劑量［10］，但由于YHRJ為復(fù)方制劑，具體應(yīng)用時(shí)，仍需考慮到患者的個(gè)體差異及需要實(shí)施醫(yī)師擁有更多的臨床經(jīng)驗(yàn)。