10例腎單位腎癆患兒的臨床特征和基因變異分析

方韶晗 鄧 芳 徐達良 朱 穎 周慧琴 吳 琳 朱亞鳳 彭 寅

腎單位腎癆(nephronophthisis，NPHP)是一種少見的常染色體隱性遺傳的慢性小管間質性疾病，主要形成腎囊腫病變，是兒童及青少年終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)常見原因之一。主要分型為嬰兒型、少年型、青年型，少年型最為常見。其起病較為隱匿，臨床表現為多尿、生長發育遲緩、貧血、腎功能異常等非特異癥狀，10%～20%的患者存在腎外表現，主要累及眼、肝、腦、骨骼等。NPHP由于臨床表現缺乏特異性，腎臟病理改變不顯著，造成臨床診斷困難，因此主要依賴于基因診斷。現有22個相關致病基因已被證實與NPHP發病相關，包括NPHP1～20、NPHPL1、NPHPL2，但只有約40%患兒能夠檢測到已知致病基因，其中NPHP1缺陷致病為最常見，占19.7%～29.4%。近年來，國內外均主張對臨床疑似病例進行基因檢測確診。本研究對確診的10例患兒資料進行總結，分析該病的臨床表型及基因突變特點，以提高對本病的認識，為臨床診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年6月安徽省兒童醫院腎內科就診、并經基因檢測確診為NPHP的10例腎臟病患兒病歷資料。對患兒臨床資料，包括病史、體格檢查、實驗室檢查、影像學資料、家族史進行回顧性分析。

1.2 高通量測序方法 基因檢測方法均為統一的高通量下一代測序(nest-generation sequencing, NGS)與遺傳病分析流程。收集患兒及其家庭成員外周血2～3 mL，提取基因組DNA(康為世紀血液基因組提取試劑盒)。采用家系全外顯子組測序(基因測序由北京智因東方轉化醫學研究中心有限公司完成)，用捕獲探針(IDT公司xGen? Exome Research Panel v1.0)將目標區域(51 Mb)DNA片段進行富集。使用 NovaSeq 6000系列測序儀(illumina公司)進行高通量測序(PE150)，對測序合格的數據，采用Burrows-Wheeler 軟件分析單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNVs)和小片段插入/缺失變異(small insertions and deletions，Indels)。根據同批次樣本的reads數比對，分析外顯子水平拷貝數變異(copy number variants，CNV)。使用在線分析系統 (http://Chigene.org) 對變異位點進行注釋，過濾公共人群頻率數據庫(1000Genomes、dbSNP、ESP和gnomAD)和本地數據庫的高頻變異，結合患兒臨床表型、遺傳模式、家系共分離、變異位點致病性等信息篩選候選變異位點。對篩選的SNVs和Indels進行Sanger測序驗證。通過qPCR進行外顯子水平拷貝數變異的驗證。依據美國醫學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)2015年制定的“遺傳變異分類標準與指南”和Clingen(ClinGen, http://www.clinicalgenome.org)標準對變異位點進行危害性評級。

1.3 觀察指標 記錄并分析10例患兒的家系圖，臨床特征、基因檢測結果及患兒治療預后。

2 結果

2.1 家系圖 共10例患兒通過基因檢測確診為NPHP。所有患兒及其父母(標準家系)的分子遺傳學特征見圖1。

圖1 10例患兒家系圖

2.2 臨床特征 10例患兒中，男性6例，女性4例，確診年齡4～14歲，中位年齡10.5(6,12.25)歲。其中3例患兒來自2個不相關的近親婚配家庭(患兒2、7、8)。所有患兒均以不同程度的腎功能不全為首發癥狀，就診時9例診斷為慢性腎臟病5期，1例年齡最小的患兒(患兒8，4歲)為2期。7例患兒有腎病家族史，其中患兒8和患兒10因親屬患病而行常規體檢時被診斷。腎功能不全的癥狀和體征包括：貧血(7/10例)、夜尿增多(1/10例)、水腫(1/10例)，均有面色蒼黃、乏力等表現；除患兒4合并有手、足、膝關節畸形及弱視，余9例患兒均無顯著的腎外系統病變。尿液檢查：尿蛋白陽性3例，定性+-～2+，余7例尿蛋白陰性；24小時尿蛋白定量除患兒8門診就診，未留取標本，余9例均有不同程度升高，24小時尿蛋白156～1 095 mg、尿α1-微球蛋白34.2～99.3 mg/L、尿β2微球蛋白0.98～724 mg/L、尿微量白蛋白21.82～1 679.3 mg/L、視黃醇結合蛋白19.82～50.9 mg/L、尿轉鐵蛋白5.8～83.9 mg/L、尿免疫球蛋白IgG及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶升高不明顯。影像學檢查：泌尿系超聲檢查提示腎臟彌漫性病變及體積縮小8例，合并多發及單發小囊腫3例。僅1例行腎臟病理檢查，病理學提示慢性小管間質性腎炎、NPHP。

2.3 基因檢測結果及診斷 60%(6/10)的患兒均檢出NPHP1基因純合性缺失(Exon1-20del)，診斷為NPHP1型(NPHP1，MIM: #256100)；2例(20%，患兒9、10，為同胞)鑒定為INVS c.2887C>T(p.Q963*)雜合性致病變異，診斷為NPHP2型(NPHP2，MIM: #256100)；1例(10%)為WDR19基因c.1489G>T (p.V497F)和c.1982+2T>C復合雜合變異，診斷為NPHP13型(NPHP13，MIM: #614377)；1例檢出TTC21B基因c.1656_c.1659delTCTG(p.C552Xfs*1)和c.1552T>C(p.C518R)復合雜合變異，診斷為NPHP12型(NPHP12，MIM: #613820)。所有鑒定的基因變異均經real-time PCR或Sanger測序驗證，并根據ACMG指南判定為致病性(pathogenic)或可能致病(likely pathogenic)變異。患兒1～8中鑒定基因變異與家系內的臨床表型呈現共分離，即符合孟德爾遺傳性疾病規律(見圖1)。根據檢出的INVS基因變異致病性、患兒家族病史，INVS變異與患兒表型共分離，以及復習文獻NPHP2案例報導的遺傳學特征，綜合分析后認為患兒9、10為INVS雜合性變異導致的NPHP2。

2.4 治療 10例患兒目前均進行腹膜透析腎臟替代治療，其中患兒1、患兒2、患兒7已經在腹膜透析過渡的基礎上進行了腎移植，目前未出現腎移植術后的相關并發癥，恢復良好，監測腎功能正常。其他患兒目前腹膜透析治療順利，定期入院評估。

3 討論

NPHP多在疾病晚期出現肝腎囊腫表現，尤其在疾病早期部分微小囊性病變不能被影像學發現。本組10例患兒中有6例未發現腎臟囊腫，故影像學只能作為參考依據，無法確診。腎臟病理的典型表現為腎小管基底膜完整性破壞，出現增厚、變薄、分層或者撕裂，遠曲小管和集合管擴張或囊腫形成，腎臟間質纖維化或者單核細胞浸潤。本研究中僅一例患兒進行腎活檢，病理改變為慢性小管間質性腎炎，符合NPHP特征性的病理改變，臨床上多數患兒發病時已處于ESRD，已無法行腎活檢檢查明確發病原因，因此隨著基因診斷技術的發展，基因檢測已被公認為NPHP確診的唯一有效方法。

NPHP本質上是一種纖毛病，即由于纖毛結構或功能缺陷導致的腎組織病變，因此在理論上，NPHP患者可能合并有多系統病變，包括視網膜退化、肝纖維化、小腦發育不良和智力障礙。在以往報導的NPHP1(MIM: #256100)案例中，大多非近親婚配家庭的患者有包含NPHP1基因在內的純合性2q13微缺失，表明該微缺失是一個熱點變異。這種染色體微缺失致病的分子遺傳機制暗示NPHP1患者的表型異質性，可伴或不伴其他腎外表現(如眼、腦、肝、心臟等)，可能與微缺失的范圍有關。本研究納入的患者60%為NPHP1基因純合缺失，提示2q13微缺失可能也是我國人群熱點變異。此外這6例患者中除了2例有高血壓外，均無其他腎外表現，這可能與人群異質性或涉及缺失實際區域大小有關。

NPHP1基因純合缺失的發生機制也可能與單親二倍體(uniparental disomy，UPD)有關，這類患者可能檢出“新發(de novo)”的NPHP1雜合性缺失，加上遺傳自父母的1條雜合性NPHP1雜合性缺失染色體構成純合性缺失。本研究中，測序分析表明，患兒2的2號染色體(chr2:108443511-122288615)存在13.8 M的UPD，此區域包含NPHP1基因，但由于父母為近親，無法通過數據分析判斷該UPD是父源還是母源，僅根據NPHP1的變異情況，推斷發生了父源UPD。INVS基因又名NPHP2，導致嬰兒型NPHP，患兒通常表現為囊性腎臟腫大，4歲以內進入終末期腎病。Halbritter等在2例青少年型NPHP患者中發現，INVS基因單雜合變異致病的案例，表明目前對于INVS相關NPHP的了解還有待深入，除罕見的顯性遺傳方式(環境因素等可能造成外顯率改變)外，不排除潛在的雙基因遺傳、修飾基因缺陷等特殊的遺傳方式。患兒9和10為親姐弟，在INVS基因只檢測到c.2887C>T(p.Q963*)雜合變異，在該基因上未發現其他可疑變異位點。筆者推測INVS基因導致患者年齡分布廣泛，從嬰兒型到青少年型NPHP發生均與該基因變異有關。本研究納入的患兒9和10臨床表現與INVS基因相關度高，且已經發現有單個雜合致病性變異，提示可能存在另外一個致病性變異。由于全外顯子組測序只對基因組編碼區域進行捕獲，無法檢測到深度內含子區變異，同時對單個外顯子缺失/重復檢測不夠靈敏，也無法檢測到倒位、易位等復雜變異類型。全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)在檢測染色體結構變異方面有很大優勢，檢測單個外顯子缺失/重復靈敏度高，通過WGS，有望進一步探索該2例患兒遺傳病因。

近些年，新鑒定的NPHP相關基因包括TTC21B和WDR19，兩者均編碼參與纖毛功能調控的蛋白質，所導致的NPHP被分別命名為NPHP12(MIM: #613820)和NPHP13(MIM: #614377)，但已知的報導很少。Davis等在2個不相關家庭的NPHP患者中均鑒定了TTC21B純合性變異，然而作者并未提供詳細的臨床資料。根據本研究患兒6的臨床特征，中國兒童NPHP13與NPHP1的表型類似，并未發現顯著的腎外病變。目前，已報導的WDR19缺陷導致NPHP13病例均有兒童期-青少年期的腎外病變或異常，包括視網膜微動脈瘤、發育遲緩、多種睫狀體病變、肝內膽管擴張、胰腺和肝囊腫等，與本研究患兒4的眼異常特征一致，同時患兒4合并有四肢關節受累，可能與不同遺傳背景，或合并其他先天性疾病有關。因此，本研究中所鑒定的NPHP12和NPHP13案例，為該類疾病的基因型-表型譜提供了寶貴的研究材料。

綜上所述，本研究NPHP患兒起病隱匿，早期臨床表現不顯著，而多數患兒在腎功能嚴重受損前，往往沒有腎活檢的適應證，因此臨床診斷NPHP時，大多已進入慢性腎臟病5期。因此建議對于兒童-青少年期診斷困難、特別是有家族史的腎病患者，考慮一線進行基因檢測。本研究中10例患兒均發病隱匿，最長確診時間為6年。如能早期確診，既能延緩慢性腎功能衰竭的病程，又能減少藥物不良反應發生，還可以進行家庭生育指導。此外，本研究鑒定了罕見的NPHP12和NPHP13案例，表明以往對于TTC21B和WDR19變異致病可能是低估的，在腎病患者的基因檢測中，應充分考慮新致病基因的可能性。