Ⅰ型和Ⅱ型酮病奶牛系統性炎癥和肝損傷狀態的分析與比較

陳喜瑩，范明赫，白洪旭，李 偉，宋玉祥，李心慰，劉國文，王 哲，杜希良，李小兵

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

奶牛酮病是圍產期高發和頻發的一種以能量代謝障礙為基礎的營養代謝紊亂性疾病。產后奶牛能量攝入不能滿足能量需求，導致機體處于能量負平衡狀態，發生體脂動員，生成大量游離脂肪酸(NEFA)，在肝臟中不完全氧化生成大量酮體(β-羥丁酸(BHBA)、乙酰乙酸和丙酮)并釋放到血液中。當血液中酮體含量高于1.2 mmol/L時，便可診斷為酮病[1]。酮病奶牛通常表現為精神沉郁、消化機能紊亂、產奶量下降、體質量減輕等，嚴重影響奶牛的免疫性能、生產性能和經濟效益[2]。另外，酮病增加其他疾病的患病風險，包括乳房炎、子宮內膜炎、真胃變位和胎衣不下等[3]。因此，酮病的防治對于圍產期奶牛健康至關重要。

根據酮病發病機理的差異，HOLTENIUS等[4]將奶牛酮病分為Ⅰ、Ⅱ型酮病。Ⅰ型酮病又稱饑餓型酮病，主要由于泌乳對糖的需求超過糖異生的能力，血漿中葡萄糖(Glu)和胰島素的濃度降低，進而引起脂類不完全氧化作用加強，導致酮體生成增加。Ⅰ型酮病奶牛以低血糖、低胰島素、高NEFA和高血酮為特征，多發生于產后的3～6周[2]；Ⅱ型酮病與人類Ⅱ型糖尿病相似，其病理基礎是脂肪肝和胰島素抵抗(IR)，由于脂質在肝細胞中蓄積誘發胰島素抵抗，導致肝臟對脂質完全氧化過程減弱，使酮體生成增加。此外，肝臟胰島素耐受性降低減少了Glu的吸收，故Ⅱ型酮病以高血糖或血糖正常、高胰島素和高NEFA血癥為特征，且常伴發乳房炎等其他疾病，常發生于產后早期(泌乳5～15 d)[5]。

已有研究表明Ⅰ型酮病奶牛血清中包括結合珠蛋白(HP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性相關因子的濃度增加[6]，說明Ⅰ型酮病奶牛存在系統性炎癥，然而Ⅱ型酮病奶牛是否存在類似情況尚不清楚。另外，有研究報道患有肝損傷的產后奶牛更容易發生Ⅱ型酮病[7]。肝臟是糖代謝的重要器官，肝臟受損，機體出現糖代謝異常，胰島素作用減弱，機體呈現不同程度的胰島素抵抗，導致血糖不能及時進入細胞供能[8]。因此，肝功能受損引起的糖代謝紊亂可能是引起機體發生IR，誘發Ⅱ型酮病的重要因素。雖然已有報道Ⅰ型酮病奶牛表現為肝損傷[9]，但Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛肝損

傷程度是否存在差異并不清楚。因此，本試驗通過分析與比較Ⅰ、 Ⅱ型酮病血液中炎性和肝功能相關指標的差異，剖析不同類型酮病奶牛的發病機理，以期為酮病的診斷、防治及監測提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物荷斯坦奶牛均選自吉林省長春市某奶牛場，所有奶牛接受常規體檢確保沒有其他并發癥的存在。根據Glu、BHBA和NEFA的含量選擇健康奶牛20頭、Ⅰ和Ⅱ型酮病奶牛各20頭。健康奶牛的判斷標準包括：無異常的臨床表現、各項臨床指征(呼吸、脈搏、體溫等)均正常，血液生化指標BHBA<1.2 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L；Ⅰ型酮病奶牛的判定標準為BHBA>1.20 mmol/L、Glu<2.80 mmol/L；Ⅱ型酮病奶牛的判定標準為BHBA>1.20 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L[10]。

1.2 樣本采集通過臨床診斷，分別篩選健康和Ⅰ、Ⅱ型酮病的奶牛各20頭作為試驗對象，于清晨飼喂前頸靜脈無菌采集試驗牛的血液樣本。所采靜脈血置于10 mL肝素鈉抗凝劑內用于分離血漿，10 mL置于未加抗凝劑的離心管中用來分離血清，3 800×g離心10 min，收集血漿(血清)，做好標記后，-20℃短期保存，-80℃長期保存(6個月內)。

1.3 試劑血液樣品中Glu、NEFA和BHBA含量用Hitachi自動生化分析儀以及商用檢測試劑盒檢測；檢測急性期反應蛋白HP、SAA的 ELISA 檢測試劑盒購自CUSABIO 公司；炎性因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、TNF-α 的ELISA 檢測試劑盒購自CUSABIO 公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

2 結果

2.1 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛臨床參數和能量代謝指標的比較如表1所示，Ⅰ型酮病奶牛的體況評分(BCS)顯著低于健康奶牛和Ⅱ型酮病奶牛，而Ⅱ型酮病奶牛的BCS高于健康奶牛和Ⅰ型酮病奶牛；Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的產奶量均顯著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛產量更低。此外，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的NEFA和BHBA均顯著高于健康奶牛，而血糖(Glu)水平均顯著低于健康奶牛，但Ⅱ型酮病奶牛的Glu水平高于Ⅰ型酮病。結果表明，Ⅰ型酮病奶牛存在能量負平衡；Ⅱ型酮病常發生于肥胖奶牛，表現為血液高NEFA和高Glu。

表1 健康奶牛與Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛臨床參數和能量代謝指標比較(n=20)

2.2 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛急性期反應蛋白的比較如圖1所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病中急性期反應蛋白SAA和HP的質量濃度均顯著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP的質量濃度顯著高于Ⅰ型酮病奶牛。結果表明，酮病發生時，機體存在損傷并觸發急性反應，且Ⅱ型酮病奶牛的損傷程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

圖1 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中急性期反應蛋白SAA(A)和HP(B)的質量濃度

2.3 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛炎性相關指標的比較如圖2所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量均顯著高于健康奶牛，且這些促炎因子在Ⅱ型酮病奶牛血液中高于Ⅰ型酮病奶牛；抗炎因子IL-10的水平在Ⅰ、Ⅱ型酮病中顯著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的IL-10水平低于Ⅰ型酮病奶牛。結果表明，酮病發生時，機體存在系統性炎癥，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性水平更高。

圖2 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中促炎因子IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)以及抑炎因子IL-10(D)的質量濃度比較

2.4 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛肝臟功能相關指標的比較檢測Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷指標，發現酮病奶牛血液AST和ALT的活性顯著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的AST和ALT活性高于Ⅰ型酮病奶牛(圖3)；表明酮病奶牛表現為肝損傷，且Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷程度更加嚴重。

圖3 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛中肝損傷相關指標AST(A)和ALT(B)的活性比較

3 討論

酮病是普遍發生于奶牛圍產期的一種代謝性疾病，其發生與產后初期采食恢復緩慢及泌乳早期體內的能量無法滿足泌乳需求所致的能量負平衡有關[11]。雖然Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛中均存在能量負平衡，但是由于Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的發病機理不同，其病理變化和代謝狀態可能存在差異[2]。因此本試驗比較分析了Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的急性期反應蛋白(HP和SAA)、炎性相關指標(IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α)和肝損傷指標(ALT和AST)的差異，發現Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在急性反應、系統性炎癥和肝損傷，但Ⅱ型酮病奶牛更加嚴重。本試驗為解析酮病，尤其是Ⅱ型酮病的發病機理提供數據支撐。

糖脂代謝紊亂是酮病奶牛的代謝特征[12]，本試驗也發現酮病奶牛血液NEFA和BHBA的濃度顯著高于正常奶牛，而高濃度的NEFA和BHBA具有脂毒性，能夠引起急性反應[13]。SAA和HP是由肝細胞分泌到血清中的急性反應蛋白，當機體發生感染或損傷時，可迅速升高[14]。本試驗發現酮病奶牛的SAA和HP水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP水平均高于Ⅰ型酮病奶牛；這表明Ⅱ型酮病奶牛的機體損傷程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

急性反應常伴隨著炎性反應的發生，另外有研究表明奶牛Ⅱ型酮病與人類Ⅱ型糖尿病相似[15]，且促炎細胞因子可作為評價Ⅱ型糖尿病嚴重程度的關鍵指標。本試驗中，酮病奶牛的促炎因子水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的促炎因子水平高于Ⅰ型酮病奶牛，表明Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在炎性反應，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性反應要高于Ⅰ型酮病奶牛，這與急性反應蛋白的表達是一致的。促炎因子TNF-α和IL-1β等在肝臟脂質代謝障礙引發脂肪肝的生成中發揮著重要的作用[16]。高水平TNF-α或IL-1β能夠導致肝臟胰島素抵抗，使血漿中的NEFA升高[17]。同時，促炎因子能夠抑制脂肪細胞中脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性[18]，從而使脂肪細胞脂解增強，提高血液NEFA含量。高濃度NEFA具有脂毒性能夠使巨噬細胞分泌多種促炎因子，繼而加劇肝臟和脂肪組織的脂代謝紊亂，形成一個惡性循環[19]。本試驗中，Ⅱ型酮病奶牛血液炎性因子和Glu水平高于Ⅰ型酮病奶牛，說明Ⅱ型酮病奶牛的系統性炎癥和糖脂代謝更加嚴重，也說明Ⅱ型酮病奶牛存在嚴重的IR，而這可能是Ⅱ型酮病更難治療的潛在原因。

ALT和AST是衡量肝損害程度的特征性指標[20]。正常情況下，AST在血液中的含量較少，但是當肝細胞損傷嚴重時，AST的活性會升高并大量釋放到血液中[21]。ALT主要貯存在肝細胞胞漿內，能夠反映肝細胞的完整性。孫菲菲等[22]研究表明高濃度的NEFA、BHBA以及炎性因子會引起肝損傷；與此研究一致的是，酮病奶牛存在明顯的肝損傷，且Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷指標AST和ALT的活性也顯著高于Ⅰ型酮病和健康奶牛，說明Ⅱ型酮病奶牛肝損傷更加嚴重，這可能是高濃度的NEFA和BHBA以及大量的促炎因子引起的。同時，肝損傷也會加重Ⅱ型酮病，增加治療難度。

總之，酮病發生時機體存在系統性炎癥和肝損傷，而且與Ⅰ型酮病相比，Ⅱ型酮病奶牛炎性反應和肝損傷更加嚴重。因此，了解酮病奶牛炎性因子和肝功能指標的變化情況，能夠更好地區分不同類型的酮病，對不同類型的酮病進行針對性治療提供依據。