人參莖葉皂苷和硒溶液(GSe)增強豬偽狂犬病疫苗免疫反應

王 勇,袁麗佳，胡松華

(浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)所引起的動物傳染病，PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒屬。PRV對養豬業危害極大，成年豬呈隱形感染，長期帶毒排毒，這是導致PR長期流行、難以根除的重要原因，嚴重影響豬場的產能和效益，是制約我國養豬業健康發展的重要疾病之一。接種疫苗是防控該病的重要措施。我國將PR列入優先防制的動物疫病之一[1-3]。然而，在生產中，有些PR疫苗的免疫效果差，不能誘導動物產生有效的免疫反應，導致PR在一些豬場得不到有效控制[4]。因此，尋求提高豬PR疫苗免疫效果的方法，對臨床上控制PR具有重要意義。

人參莖葉皂苷(GSLS)是一種從人參的莖和葉中獲得的提取物。研究表明，GSLS對多種動物疫苗如口蹄疫疫苗、雞新城疫疫苗、H5N1禽流感滅活疫苗和PR弱毒疫苗等具有免疫增強作用[5-7]。以GSLS為主要成分的人參莖葉總皂苷顆粒已由農業農村部批準為新獸藥((2017)新獸藥字證20號)上市[8]。硒(Se)作為一種微量元素，具有增強機體免疫的作用，廣泛應用在畜牧業生產中[9-10]。BABAR等[11]研究發現，給小鼠口服GSLS后接種添加了Se的PR疫苗能顯著提高疫苗的免疫效果。為了進一步豐富和優化GSLS和Se在臨床上的應用，本試驗以小鼠為模型，研究一種含GSLS和Se的GSe溶液對PR疫苗的免疫增強作用，并探討其作用機理，為臨床上提高動物的抗病力提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物ICR小鼠，雌性，6～8周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠自由采食與飲水，飼養于IVC獨立送風飼養籠具，室內條件為溫度(25±1)℃，濕度50%±10%。小鼠于試驗開始前適應性飼養1周。

1.2 細胞、病毒和疫苗小鼠巨噬細胞系RAW 264.7由浙江大學動物科學學院中獸醫研究室保存；偽狂犬病病毒野毒株(fPRV)，由浙江省農業科學院惠贈；PR疫苗購自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 主要試劑和藥品豬PRV gB抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；人參莖葉皂苷(GSLS)購自吉林宏久生物科技股份有限公司；亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se)購自上海今品化學技術有限公司；刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和MTT購自Sigma公司；DMEM培養基、1640培養基、Hank’s液、胰酶消化液(0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA)購自杭州吉諾生物醫藥有限公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a抗體購自Santa Cruz公司；紅細胞裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；FITC標記的CD40 (Clone:HM40-3)、CD80 (Clone:16-10A1) 和CD86 (Clone:GL1)流式抗體購自ebioscience公司；小鼠 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自杭州聯科生物科技有限公司。

1.4 GSe注射次數對PR疫苗誘導抗體水平的影響將小鼠隨機分為8組，每組6只，第1～3組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射0.2 mL GSe溶液(6 μg GSLS + 2 μg Se)1，2，3次；第4～6組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射等量的生理鹽水1，2，3次；第7，8組小鼠分別為PR疫苗對照組和空白對照組。每只小鼠每次免疫稀釋100倍的PR疫苗0.1 mL(下同)，免疫2次，間隔2周二免，于二免后2周對小鼠進行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清中gB抗體水平。

1.5 GSe注射劑量對PR疫苗誘導抗體水平的影響將小鼠隨機分為5組，每組6只，第1～3組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射質量濃度為(30 mg/L GSLS + 10 mg/L Se)的GSe溶液 0.1，0.2，0.3 mL；第4，5組小鼠分別為PR疫苗對照組和空白對照組。每只小鼠免疫2次，間隔2周二免，于二免后2周對小鼠進行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清中gB抗體水平。

1.6 動物分組及免疫將小鼠隨機分為3組，每組6只，第1組小鼠免疫PR疫苗前，肌肉注射1次GSe溶液0.2 mL(30 mg/L GSLS + 10 mg/L Se)，第2，3組小鼠分別為PR疫苗對照組和空白對照組。每只小鼠免疫2次，間隔2周二免，于二免后1，2，3周對小鼠進行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清中gB抗體及其亞類水平。二免后3周分離脾臟，制備脾淋巴細胞，檢測淋巴細胞增殖反應和細胞因子水平。

1.7 gB抗體及其亞類檢測按ELISA檢測試劑盒說明檢測血清中特異性PRV gB抗體水平。使用同樣的ELISA檢測試劑盒，向試劑盒包被板中加入100 μL/孔的待檢測血清(1∶2稀釋)，室溫條件下孵育60 min，洗滌液洗板3～5次，將板拍干，每孔加入100 μL HRP標記的山羊抗鼠IgG1或IgG2a抗體(1∶1 000)，37℃孵育60 min;洗滌液洗板3～5次，將板拍干，每孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫條件孵育15 min后每孔加入50 μL終止液，在酶標儀上測定D450 nm值。

1.8 攻毒保護試驗小鼠加強免疫后2周，腹腔注射致死劑量的fPRV(5×105TCID50)，連續觀察10 d，并記錄小鼠臨床癥狀和死亡情況。

4月18日，水利部抗震救災前方領導小組組長、青海省水利廳抗震救災前線指揮部總指揮于叢樂廳長、副總指揮張世豐、張偉副廳長分別帶領搶險分隊深入一線，詳查供水設施、禪古電站安全隱患，巡查巴塘河、扎西科河兩岸滑坡淤塞河道情況，研究應急供水和禪古電站水庫大壩應急處置方案。

1.9 淋巴細胞增殖試驗將小鼠斷頸處死，于75%酒精浸泡5 min；無菌條件下分離脾臟，加入5 mL完全Hank's液，使用研缽研磨后過200目銅網，濾液離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清，向底物中加入3 mL紅細胞裂解液，輕輕振蕩混勻；4℃靜止3 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀物中加入3 mL RPMI-1640完全培養基，重懸后進行細胞計數，并調整細胞濃度至5×106個/mL，加入到96孔細胞培養板中，100 μL/孔。隨后，分別使用5 mg/L Con A、5 mg/L LPS和5×105TCID50/mL滅活fPRV (水浴56℃滅活30 min)抗原刺激小鼠脾淋巴細胞，在恒溫培養箱中37℃、5% CO2培養44 h，向每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)后繼續培養4 h后，離心培養板(1 800 r/min 10 min)并小心棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩溶解結晶后置于酶標儀上測量D570 nm。刺激指數(SI)的計算公式如下：SI=(刺激孔D值-空白孔D值)/(未刺激孔D值-空白孔D值)。

1.10 細胞因子檢測按1.9方法收集脾細胞，調整細胞濃度至5×106個/mL，5×105TCID50/mL滅活fPRV (水浴56℃滅活30 min)抗原刺激小鼠脾淋巴細胞，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養48 h后，收集上清液，按ELISA試劑盒說明書操作步驟，檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的分泌水平。

1.11 GSe對巨噬細胞的影響將巨噬細胞RAW 264.7按5×105個/孔加到24孔培養板中，在37℃、5% CO2條件下培養24 h后，使用GSe(60 μg/L GSLS + 20 μg/L Se)和LPS(100 μg/L)刺激細胞；只加DMEM完全培養基的為細胞對照組，在37℃、5% CO2條件下培養24 h后，離心收集細胞上清液，使用ELISA檢測試劑盒測定細胞因子IL-6、IL-10和TNF-α水平。收集細胞，使用1% BSA-PBS將細胞洗2次后，用CD16/CD32抗體阻斷FcR 10 min，并將細胞用FITC標記的CD40、CD80 和 CD86避光條件下染色30 min。染色結束后，1 500 r/min 離心8 min， 收集細胞，將細胞用PBS重懸后，上機檢測細胞表面共刺激分子的表達水平。

2 結果

2.1 注射不同次數的GSLS-Se對PR疫苗誘導抗體反應的影響由圖1A可知， 與PR疫苗組和免疫前注射生理鹽水組相比，PR疫苗免疫前分別肌肉注射0.2 mL含6 μg GSLS + 2 μg Se的GSe溶液1，2，3次(0.2 mL·次-1·d-1)均能顯著提高二免后2周小鼠血清中PRV特異性gB抗體水平(P<0.05)。

圖1 注射不同次數(A)和不同劑量(B)GSLS-Se對PR疫苗抗體反應的影響

2.2 注射不同劑量GSLS-Se對PR疫苗誘導抗體反應的影響由圖1B可知，與PR疫苗組相比，PR疫苗免疫前分別肌肉注射0.1，0.2 mL GSe溶液(30 mg/L GSLS+10 mg/L Se)，能夠顯著提高小鼠血清中PRV特異性gB抗體水平(P<0.05)，當注射體積為0.3 mL時， gB抗體水平只是較疫苗對照組在數值上有所提高(P>0.05)。

2.3 GSe提高小鼠血清特異性PRV gB抗體及其亞類水平由圖1結果可知，確定免疫前給小鼠肌肉注射1次GSe溶液(0.2 mL含6 μg GSLS+2 μg Se的溶液)為最終注射方案。由圖2A～C可知，與疫苗組相比，免疫前注射GSe溶液(GSe/pre-PR)能誘導小鼠產生更高水平的血清PRV特異性IgG及其亞類(P<0.05)。

2.4 GSe提高PR疫苗免疫小鼠的攻毒保護作用在攻毒試驗中，攻毒fPRV后48 h，空白對照和GSe對照組小鼠首先出現啃咬后背、瘙癢、抽搐、共濟失調和癱瘓等明顯的神經癥狀，并在攻毒后60～72 h全部死亡。疫苗對照組小鼠在攻毒后60～72 h開始死亡，最終小鼠存活率為40%(4/10)，這一結果低于GSe/pre-PR組小鼠的70%(7/10)(圖2D)。

圖2 GSe對PRV 特異性IgG及其亞類水平(A～C)和免疫小鼠攻毒后生存率(D)的影響

2.5 GSe增強免疫小鼠脾淋巴細胞增殖反應能力由圖3知，與PR疫苗組相比，GSe/pre-PR組小鼠脾淋巴細胞經ConA、LPS和PRV抗原刺激后的增殖能力顯著提高(P<0.05)。

2.6 GSe提高免疫小鼠脾淋巴細胞細胞因子水平由圖4可知，與PR疫苗組相比，GSe/pre-PRV能夠顯著增強免疫小鼠脾淋巴細胞經PRV抗原刺激后Th1型(IFN-γ和IL-2)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細胞因子的分泌能力(P<0.05)。

A.ConA;B.LPS;C.PRV

圖4 GSe/pre-PR對小鼠脾淋巴細胞細胞因子水平的影響

2.7 GSe增強巨噬細胞細胞因子分泌水平由圖5可知，與細胞對照組相比，當使用含60 μg/L GSLS和20 μg/L Se的GSe刺激RAW264.7細胞24 h后，細胞因子IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平顯著提高(P<0.05)。

圖5 GSe對巨噬細胞RAW264.7細胞因子分泌的影響

2.8 GSe提高巨噬細胞表面共刺激分子的表達水平由圖6可知，與細胞對照組相比，當使用含60 μg/L GSLS和20 μg/L Se的GSe刺激巨噬細胞RAW264.7 24 h后， GSe能夠顯著提高細胞表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達水平(P<0.05)。

圖6 GSe對巨噬細胞RAW264.7細胞表面共刺激分子表達的影響

3 討論

體液免疫在宿主防御PRV過程中發揮著重要的作用[12]。作為一種PRV囊膜表面的糖蛋白，gB能夠有效誘導機體產生具有保護性的抗體，可作為評價接種PR疫苗后誘導產生的體液免疫水平[13]。本試驗中，GSe溶液能夠顯著提高免疫小鼠血清gB抗體及其亞類(IgG1和IgG2a)水平，說明GSe能增強PR疫苗誘導產生的體液免疫水平。細胞免疫在機體抗病毒免疫中發揮著至關重要的作用。通常，淋巴細胞增殖反應和細胞因子水平可作為評價細胞免疫水平的指標。對淋巴細胞而言，Con A主要刺激T細胞，LPS主要刺激B細胞[14]。本研究結果顯示，與對照組相比，GSe/pre-PR能顯著提高脾淋巴細胞對Con A、LPS和PRV抗原刺激后的增殖能力。細胞因子在Th細胞分化過程中起重要作用，可誘導Th細胞分化產生Th1和Th2型等細胞因子。其中，Th1型免疫主要產生IFN-γ、IL-2、IL-12和IgG2a，Th2型主要產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IgG1[15]。本研究結果顯示，GSe/pre-PR能夠顯著提高小鼠淋巴細胞Th1型(IFN-γ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細胞因子水平，說明GSe/pre-PR能夠提高小鼠Th1/Th2型細胞免疫水平。此外，攻毒試驗是評價疫苗對機體保護力的重要指標。在本試驗中，GSe/pre-PR組小鼠攻毒后的最終存活率為70%，高于PR疫苗組的40%。綜上說明，GSe溶液能同時提高PR疫苗誘導動物產生有效的體液免疫和細胞免疫水平。

作為一種抗原提呈細胞(APC)，巨噬細胞是連接固有免疫和適應性免疫的重要免疫細胞。T細胞經“MHC-抗原肽-TCR”作為第一信號刺激后，還需APC表面的共刺激分子如CD40、CD80、CD86等作為第二信號刺激后才能活化[16]。活化的T細胞可促進APC活化并表達更多的共刺激分子，進一步促進T細胞活化和增殖[17]。激活的巨噬細胞可分為M1型和M2型，M1型細胞分泌IL-6和TNF-α等促炎細胞因子參與Th1型免疫；M2型細胞主要發揮免疫調節作用，可分泌抗炎細胞因子IL-10、TGF-β和一些趨化因子，促進Th2型細胞免疫應答反應[18]。本研究結果顯示，GSe能通過提高IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平來促進RAW264.7細胞的活化，說明GSe能夠同時激活M1和M2型巨噬細胞。此外，GSe可通過提高CD40、CD80和CD86的表達水平增強巨噬細胞的抗原提呈能力。由此說明， GSe溶液對PR疫苗的免疫增強作用與其提高巨噬細胞的活性有關，而GSe能同時誘導動物產生Th1和Th2型免疫應答反應，很可能與GSe能誘導平衡的M1/M2巨噬細胞分化相關。

本試驗結果表明，GSe溶液能提高小鼠對PR疫苗的體液和細胞免疫應答水平，并增強免疫動物對PRV的抵抗能力。同時，GSe可通過提高巨噬細胞細胞因子水平和抗原提呈能力發揮其免疫增強作用。但GSe溶液在臨床上如何提高動物抵抗疫病方面還有待進一步研究。