酮病奶牛血液極低密度脂蛋白(VLDL)的分泌特征

王 爽，任 捷，郭行健，劉祿情，張冰冰，趙瑩瑩，麻芯茹，李 銘，徐 闖*，楊 威*

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

近年來，隨著我國奶牛產業的高速發展，奶牛泌乳性能不斷提高，奶牛相關營養代謝類疾病的發病率也持續增長，酮病是高產奶牛營養代謝類疾病中最常見的一種。酮病多發于奶牛圍產期，臨床上常出現低血糖、高酮血、酮尿、酮乳，消化功能紊亂，產奶量下降，體質量減輕等癥狀,個別奶牛甚至可能出現神經癥狀，且增大患其他圍產期疾病的風險[1]。

奶牛酮病的發生與能量負平衡(NEB)及體脂動員有關，常于妊娠期最后2周和泌乳早期(產后0～70 d) 發病[2]。當奶牛發生能量代謝負平衡時，會引起血液中葡萄糖含量的降低，體脂開始動員，產生大量的非酯化脂肪酸(NEFAs)，經過血液循環進入肝臟，而當肝臟內出現大量的NEFAs時，超出肝臟的氧化分解能力，則會進行不完全β-氧化，產生β-羥丁酸(BHBA)、丙酮、乙酰乙酸等酮體在體內大量堆積，最終引發酮病[3]。同時在肝臟吸收過量的游離脂肪酸后，線粒體對其氧化的能力不足，就會增加肝細胞中甘油酸三酯(TAG)的合成，高爾基體內載脂蛋白B(ApoB)與TAG結合，形成極低密度脂蛋白(VLDL)并以VLDL顆粒的形式向肝外組織轉運進入血液中循環利用。

VLDL是內源性TAG由肝臟向肝外組織轉運的主要形式，其合成和分泌是一個復雜且受到嚴密調控的過程，對機體的脂質穩態起重要作用。VLDL主要由TAG、膽固醇、膽固醇酯(TC)、磷脂(PL)及ApoB100、載脂蛋白AⅠ(ApoA Ⅰ)、載脂蛋白A Ⅳ(ApoA Ⅳ)、載脂蛋白C(ApoC)及載脂蛋白E(ApoE)等脂蛋白質構成[4]。肝臟VLDL合成過程分為兩步，首先微粒體甘油三酯轉運蛋白(MTP)催化部分內質網合成的TAG使其轉移到粗糙內質網膜上發生易位的新生ApoB100上，在此過程中，新生ApoB100被部分脂化從而形成一個低脂的原始VLDL顆粒，在第二步中，原始VLDL出芽易位于平滑內質網和/或高爾基體腔與富含TAG的脂質小滴以及PL、TC及游離膽固醇結合，進而最終形成可以向肝外組織轉運的成熟VLDL顆粒[5]。

研究顯示NEB所致的酮病奶牛存在肝臟VLDL的組裝原料不足，VLDL合成分泌障礙，最終導致奶牛酮病的發生，而其致病機制目前尚不清晰。本試驗旨在明確酮病奶牛血液VLDL組成特征，為深入探究圍產期酮病奶牛肝臟VLDL合成和分泌失衡機制提供理論依據及新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本試驗在黑龍江省某千頭集約化奶牛場進行，實驗奶牛均為自由臥欄飼養，采食全混合日糧(TMR)。根據體況、年齡及胎次相近原則，隨機選取產后7～14 d奶牛，檢測其血液中酮體含量以及根據臨床癥狀選取健康奶牛(BHBA<1.2 mmol/L)、臨床型酮癥奶牛(BHBA≥3.0 mmol/L)各6頭作為實驗動物。在清晨奶牛進食前，尾靜脈采集30 mL血液備用。

1.2 VLDL顆粒分離血液樣品室溫下靜止2 h，以2 000 r/min離心20 min，取血清加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)至1%，用1.006 kg/L的NaCl + NaBr溶液2 mL覆蓋6 mL的血清，60 000×g離心30 min以從血清中去除乳糜微粒(CM)。再加入1.006 kg/L 的NaCl + NaBr溶液至8 mL，10℃、70 000 r/min 離心18 h分離VLDL。

1.3 VLDL顆粒負染色及顆粒特征觀察通過超速離心分離得到的VLDL顆粒用PBS稀釋后滴到經過輝光放電的銅網上，使其在銅網上停留1 min，該過程在冰上操作。然后將銅網用3滴去離子水快速清洗，每次清洗前后用濾紙將多余液體吸除。再滴加3滴甲酸雙氧鈾對銅網進行快速染色，每次染色前后用濾紙將多余液體吸除，最后1次滴加甲酸雙氧鈾要求其在銅網上停留5 min后吸除，甲酸雙氧鈾同樣置于冰基底上以保持低溫并遮光。染色后的銅網用濾紙從背面將多余液體吸除干凈，于常溫下自然風干后通過透射電鏡觀察VLDL顆粒特征情況。

1.4 VLDL-ApoB含量測定根據試驗分組要求，按照1.1方法獲取血清，按試劑盒說明書步驟測定不同疾病狀態下奶牛血液中VLDL-ApoB的含量。

1.5 VLDL顆粒組成中PL、TC含量測定根據試驗分組要求，分別采集不同疾病狀態下的奶牛血液超速離心得到VLDL顆粒，按照 ELISA試劑盒說明書步驟檢測健康奶牛、亞臨床酮病奶牛及酮病奶牛VLDL的主要組成成分中PL、TC的含量變化情況并比較。

1.6 VLDL顆粒代謝組學特征研究按照1.2方法獲得不同疾病狀態下奶牛血液VLDL顆粒，利用LC-MS組學技術對奶牛血液VLDL顆粒進行脂質組學檢測，分析比較其主要差異脂質。

2 結果

2.1 奶牛血液VLDL-ApoB含量檢測對不同疾病狀態下奶牛血液VLDL-ApoB含量測定結果如圖1所示。結果表明，奶牛血液中VLDL-ApoB的含量隨奶牛酮病的發病程度呈趨勢性降低，且臨床型酮病奶牛血液中VLDL-ApoB的含量顯著低于健康對照組。

2.2 奶牛血液VLDL顆粒大小觀察對不同疾病狀態下奶牛血液VLDL顆粒特征觀察結果顯示，臨床型酮病奶牛血液中VLDL顆粒均較大于健康奶牛，且臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒中較大顆粒占據較大比例(圖2)。

注：*.與健康對照組相比差異顯著 (P<0.05);**.與健康對照組相比差異極顯著 (P<0.01) 。下同

圖2 健康(左)及臨床型酮病(右)奶牛VLDL顆粒特征

2.3 奶牛血液VLDL顆粒組成中PL、TC含量測定對不同疾病狀態下奶牛血液VLDL顆粒組成中PL和TC含量測定結果如圖3所示。結果表明，奶牛血液VLDL顆粒組成中PL的含量隨奶牛酮病發生程度呈趨勢性降低，臨床型酮病奶牛血液VLDL中PL含量顯著低于健康奶牛。而對照組、亞臨床型酮病組和臨床型酮病奶牛組中TC含量差異不顯著。

圖3 VLDL顆粒組成特征

2.4 奶牛血液VLDL顆粒代謝組學分析對健康對照組奶牛及臨床型酮病奶牛血液中VLDL顆粒代謝組學檢測及分析結果如圖4所示。結果表明，臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒中不同TAG相關脂質與健康對照組無明顯差異，但磷脂相關脂質如PE-NMe(22∶0/24∶1(15Z))、PE(22∶2(13Z)/24∶1(15Z))和PE (22∶5(4Z))均顯著或極顯著低于健康對照組。

圖4 奶牛血液VLDL顆粒代謝組學分析

3 討論

圍產期奶牛健康對整個泌乳周期都至關重要，是奶牛飼養管理中最具挑戰性的時期之一。圍產期奶牛由于經歷妊娠-分娩-泌乳啟動等生理應激，以及低能飼喂到高能飼喂轉化的應激，導致奶牛由于干物質攝入減少但能量需求增加而出現NEB[6]。NEB是圍產期奶牛普遍存在的一種亞健康狀態，其會加劇圍產期其他代謝疾病酮癥、乳腺炎、乳熱、子宮內膜炎等的發生，給奶牛業帶來嚴重的經濟損失。尤其奶牛等反芻動物較單胃動物相比，其代謝過程有極大不同，雖然反芻動物與單胃動物肝臟合成TAG的速率大致相同，但反芻動物分泌VLDL的速率卻遠低于單胃動物[7]。本試驗通過采集酮病不同狀態下奶牛血液并檢測其血清中VLDL-ApoB的含量進一步證明了奶牛酮病的發生會進一步抑制VLDL的合成、組裝及分泌過程。

研究表明，ApoB決定了VLDL從肝臟分泌的顆粒大小，但并不影響其分泌數量[8]，而異常大的VLDL顆粒會降低其向肝外組織轉運的速率，進而導致更多的TAG在肝細胞內沉積。本研究結果證實奶牛酮病的發生會抑制VLDL-ApoB分泌的同時，進一步證明了奶牛酮病的發生會促使肝臟組織向血液中分泌更大的VLDL顆粒，從而說明了ApoB與VLDL顆粒大小兩者之間的相互作用關系對奶牛體內TAG的轉運及沉積的影響。TAG、PL以及TC作為VLDL顆粒合成的重要原材料，其含量變化對VLDL顆粒的合成、組裝以及分泌的影響尚不明確，但在本試驗中ELISA試劑盒以及LC-MS組學檢測結果顯示，臨床型酮病奶牛血液VLDL顆粒其組成中PL以及不同亞型的PL含量均較健康奶牛出現顯著或極顯著降低，表明在疾病狀態下PL含量的缺失可能是影響VLDL合成及組裝異常的重要因素，從而導致酮病的進一步加重，甚至促進奶牛脂肪肝的發生。

綜上所述，VLDL-ApoB分泌在奶牛酮病發生時受到抑制，同時促進了異常大小的VLDL顆粒的分泌，PL作為VLDL合成組裝的重要脂質部分，也在疾病過程中表現出了明顯異常。因此，本試驗結果表明，可以通過調控ApoB以及增加PL合成的途徑來促進VLDL顆粒的正常合成、組裝和轉運過程，從而減少TAG在肝臟內的沉積而進一步保證奶牛機體健康。