自噬在骨關節炎軟骨細胞退變中表達的研究

王浩 陳群超 殷麗麗

【摘 要】目的：探究不同退變階段骨關節炎自噬因子ULK1、Beclin1和LC3B在軟骨細胞中的表達。方法：根據Kellgren-Lawrence影像學診斷標準，收集正常軟骨樣品，中期、晚期骨關節炎軟骨樣品;體外分離、培養軟骨細胞，甲苯胺藍和Ⅱ型膠原免疫組化染色用于鑒定軟骨細胞，運用熒光定量PCR及WB技術分別從mRNA及蛋白水平檢測ULK1、Beclin1和LC3B的表達。結果：甲苯胺藍染色顯示，軟骨細胞核為深藍色，胞質中有大量異色藍紫色顆粒。膠原蛋白的免疫熒光染色顯示，細胞外基質為棕色，細胞核染為黃褐色。熒光定量PCR及WB結果顯示，正常軟骨細胞中ULK1、Beclin1、LC3B mRNA及蛋白水平穩定表達，隨著骨關節炎程度加重，其表達量逐漸減少，細胞中表達量最低的是晚期骨關節炎組，3組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。結論：隨著骨關節炎的加重，軟骨細胞自噬相關因子的表達降低。自噬是維持正常軟骨細胞穩態的保護機制，對調控骨關節炎的發展有重要的作用。

【關鍵詞】 骨關節炎;軟骨細胞;自噬;退變

Study on the Expression of Autophagy in Osteoarthritis Chondrocyte Degeneration

WANG Hao，CHEN qun-chao，YIN Li-li

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expressions of autophagy factors ULK1，Beclin1 and LC3B in chondrocytes of osteoarthritis at different stages of degeneration.Methods：According to the Kellgren-Lawrence imaging diagnostic criteria，normal cartilage samples，mid-term and late osteoarthritis cartilage samples were collected.Chondrocytes were isolated and cultured in vitro;toluidine blue and typeⅡ collagen immunohistochemical staining were used to identify chondrocytes;and the expressions of ULK1，Beclin1 and LC3B were detected by fluorescent quantitative PCR and WB Technology respectively from mRNA and protein levels.Results：Toluidine blue staining showed that the nucleus of cartilage was dark blue，and there were a large number of heterochromatic blue purple granules in the cytoplasm.Immunofluorescence staining of collagen showed that the extracellular matrix was brown and the nucleus was yellowish brown.The results of fluorescence quantitative PCR and WB showed that ULK1，Beclin1 and LC3B were stably expressed in normal chondrocytes at mRNA and protein levels.With the aggravation of osteoarthritis，the expression level gradually decreased.The lowest expression level was in the advanced osteoarthritis group，and the difference was statistically significant

（P < 0.05）.Conclusion：With the aggravation of osteoarthritis，the expression of autophagy related factors in chondrocytes decreased.Autophagy is a protective mechanism to maintain normal chondrocyte homeostasis，and plays an important role in regulating the development of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;chondroc-yte;autophagy;degeneration

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關節疾病，多發生于50歲以上的中老年人，女性發病率高于男性。軟骨細胞的減少和軟骨基質的降解是OA形成的主要病理變化，其中軟骨細胞穩態失衡起著重要的作用[1-2]。在OA的發展過程中，受損的細胞器和降解的大分子物質逐漸積聚在軟骨細胞中，破壞了軟骨細胞的平衡，細胞合成、分解代謝失衡，導致軟骨細胞功能異常，生存能力下降，細胞外基質合成能力下降，從而加速軟骨細胞的退變[3]。

自噬（Autophagy）是細胞自我降解并循環利用細胞內組分的過程，在維持細胞環境平衡和提高細胞存活率方面發揮著重要作用[4]。許多疾病的發生和進展都與自噬相關，它是自噬相關基因（Atg）參與介導的蛋白質加工修飾過程，其中Atg1、Atg6、Atg8（哺乳動物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3B）分別起到誘導者、調節者、執行者的作用[5-6]。如果可以找到調控OA軟骨細胞穩態平衡的機制，維持軟骨細胞合成、分解代謝平衡，將對治療OA有重要意義。因此，本研究使用人膝OA軟骨細胞，探究自噬在OA軟骨細胞退變中的作用，能夠為采用藥物治療OA提供理論和實驗基礎。

1 材 料

1.1 病例來源 根據Kellgren-Lawrence影像學診斷標準[7]，從蘇州市立醫院手術室進行膝關節截肢或置換術的患者中，取正常對照組5個軟骨樣品，中期、晚期OA組各10個軟骨樣品。本研究通過蘇州市立醫院倫理委員會的批準和授權，倫理審查編號為KL901126。患者均知情并簽署同意書。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）、質量分數為0.25%的胰蛋白酶溶液、

Ⅱ型膠原酶（美國Hycolon公司）;TRIzol試劑、Taq PCR反應試劑盒（中國大連寶生物公司）;dNTP Promega、逆轉錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）;抗ULK1（生產批號ab133747）、抗Beclin1（生產批號ab55878）、抗LC3B（生產批號ab48394，英國Abcam公司）。引物：自噬相關基因ULK1、Beclin1、LC3B及內參β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司設計合成。

2 方 法

2.1 軟骨細胞分離與培養 從手術室獲取的標本，用生理鹽水反復沖洗，轉移至盛有DMEM培養基的離心管中，在低溫條件下盡快轉運至實驗室進行細胞分離。在超凈工作臺內，將正常軟骨，中期、晚期OA軟骨標本用組織剪盡量剪成小于1 mm3的小塊軟骨。在物理消化的基礎上，以質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化20 min，PBS溶液清洗后加入含質量分數為0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM低糖培養基，置于37 ℃水浴箱中輕微震蕩消化30～40 min，加入胎牛血清終止消化，離心機以1000 r·min-1離心5 min，離心半徑6 cm，棄上清，即得到消化后的軟骨細胞。將上述獲得的軟骨細胞接種于10 cm培養皿中，置于37 ℃恒溫、體積分數為5%的CO2及飽和濕度的孵箱中培養，定期更換培養液。

2.2 倒置顯微鏡下觀察并繪制生長曲線 倒置顯微鏡下觀察不同時期軟骨細胞的形態、黏附、生長特性和密度，MTT比色法繪制細胞生長曲線，監測細胞增殖。

2.3 細胞爬片制作 將經過處理后的蓋玻片放在6孔板中，以1×104·mL-1，每孔2 mL的密度在6孔板中接種第2代軟骨細胞，將其置于37 ℃的培養箱中，并以體積分數5%的CO2進行培養;當蓋玻片上軟骨細胞的融合率達到約80%時，用PBS溶液洗滌3次，用質量分數為4%的多聚甲醛固定30 min，然后用雙蒸餾水洗滌3次。

2.4 軟骨細胞爬片甲苯胺藍染色 將細胞玻片放在染色架上，加入適量質量分數為1%的甲苯胺藍染料溶液，并在室溫下染色30 min;用雙蒸水洗去多余的染料溶液;用水和無水乙醇梯度干燥，每次約2 min;安裝后使用中性樹膠，并使用倒置顯微鏡進行觀察和記錄。

2.5 軟骨細胞爬片Ⅱ型膠原免疫組化染色 將細胞玻片放在染色架上，并與未接種的動物血清在室溫下孵育10 min;使用1∶100的兔抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，4 ℃過夜;用PSB溶液加溫后在37 ℃沖洗45 min，加入滴滴標記的二抗生物素，在室溫下孵育10 min;DAB顯色5～10 min，蘇木精染色2 min，鹽酸酒精辨別;用雙蒸餾水輕輕沖洗10～15 min;用無水乙醇和中性膠干燥，并用倒置顯微鏡觀察和捕獲圖像進行記錄。

2.6 熒光定量PCR檢測 將細胞接種到板中的軟骨細胞中，通過三唑法從軟骨細胞中提取RNA，并通過DNA蛋白質分析儀的凝膠電泳確定RNA的含量和純度，以及RNA片段的完整性。逆轉錄試劑盒用于將RNA逆轉錄為cDNA，PCR試劑盒用于檢測人ULK1、Beclin1及LC3B mRNA，ACTB（β-actin）用作基因內部參考。使用2-ΔΔCT方法分析相應的基因表達，并為每個樣品定義3個重復樣品。引物序列見表1。

2.7 Western blot 檢測 使用預冷的軟骨細胞蛋白提取物進行總蛋白提取;使用BCA方法確定蛋白質濃度;SDS-PAGE電泳;確定作為目標蛋白質體積大小的轉移時間，轉移后迅速除去膜并在TBST溶液中洗滌3 min，然后將溶液封閉1 h;在室溫下將一抗孵育2 h，然后用TBST洗滌膜;將二抗孵育2 h，每次用TBST清洗膜10 min，共3次，然后添加ECL顯色溶液進行曝光和顯影。使用Image J軟件分析目標蛋白質范圍的灰度值，并使用內部對照進行半定量分析。

2.8 統計學方法 采用SPSS V25軟件進行統計分析。計量資料以表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單向方差分析。成對比較通過SNK方法在多個組中進行測試;如果方差是不規則的，或者組間的均值差異很小，則可以將Kruska l -Wallis

秩和檢驗用于多個獨立樣本。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 原代軟骨細胞倒置相差顯微鏡觀察 在倒置相差顯微鏡下，可以觀察到原代正常軟骨細胞是球形的，大小均勻。培養8～12 h后，細胞開始黏附在壁上。附著后，軟骨細胞表現為短梭形。2～

3 d后，擴展為多邊形。擴散很明顯，可以看到成簇，并且在部分區域軟骨細胞呈集落生長。第1代細胞貼壁時間縮短，增殖速度加快，見圖1;第2代和第3代軟骨細胞的生長速度快于第1代，而第4代軟骨細胞生長緩慢。

3.2 軟骨細胞生長曲線 為了監測軟骨細胞的增殖，筆者使用MTT比色法繪制細胞生長曲線。第2代正常軟骨細胞經培養后，增殖在前5 d緩慢，5～7 d加速，7～9 d顯著增加，9～11 d增殖趨緩。隨著傳代次數的增加，軟骨細胞增殖的頂點變得越來越少，速度越來越慢。見圖2。

3.3 軟骨細胞的鑒定 為了在體外鑒定分離的軟骨細胞，筆者在原代軟骨細胞切片上進行了甲苯胺藍染色，并用免疫組化檢測軟骨細胞標志物Ⅱ型膠原表達。

用甲苯胺藍將軟骨細胞染色，并在倒置顯微鏡下觀察。細胞核為深藍色，胞質為藍紫色，可見1～

2個細胞核，染色陽性，見圖3;化學染色后的Ⅱ型

膠原免疫染色組，細胞質和細胞膜為黃棕色，染色較深，細胞核未染色，細胞核為黃褐色，在細胞周圍可見黃褐色顆粒，染色呈陽性表現，見圖4。

3.4 不同退變階段OA軟骨細胞中自噬相關基因的表達變化 在正常軟骨細胞中，可以檢測到自噬相關基因ULK1、Beclin1及LC3B穩定表達，隨著OA程度加重，其表達量逐漸降低，表達量最低的是晚期OA組軟骨細胞，3組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

3.5 不同退變階段OA軟骨細胞中自噬相關蛋白的表達變化 通過蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白表達的進一步變化，結果見圖5。檢測正常軟骨細胞時，發現自噬相關基因ULK1、Beclin1及LC3B穩定表達，隨OA程度加重，其表達量逐漸減少，其中，表達量最低的是晚期OA組軟骨細胞，3組間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

4 討 論

OA是一種退行性疾病，會導致軟骨、軟骨下骨和滑膜乃至整個關節軟骨退行性改變。關節軟骨由少量的軟骨細胞和豐富的細胞外基質構成。在維持代謝穩態和細胞外基質的結構完整性中，軟骨細胞的正常功能狀態起著重要作用[8];因此，軟骨細胞在關節軟骨的發育形成、退變中扮演著重要角色。

自噬可以不斷降解細胞器和破壞大分子物質，這是細胞的自我保護機制。自噬在軟骨細胞的成熟和穩態中也起著重要作用。

本研究中，定量熒光PCR和Western blot技術分別從mRNA和蛋白水平揭示了與自噬相關因子的定量表達及其與OA的關系。研究發現，與自噬相關的基因和蛋白質在正常軟骨細胞中穩定表達，隨著OA的進展，其表達量逐漸降低，提示自噬能夠維持正常軟骨細胞代謝平衡，是正常軟骨細胞的保護機制。當軟骨細胞受損時，自噬作用被抑制，進一步加速了OA的進程。與CARAM?S等[9-10]研究結果一致。

SASAKI等[11]報道，與正常軟骨細胞相比，早期OA軟骨細胞中Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表達上調，而晚期OA軟骨中，Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表達則下調。根據上述研究結果，筆者推測，在OA早期，自噬作為恢復軟骨細胞穩態的最初嘗試，為了保護軟骨細胞穩態平衡，其表達將增加。如果高強度破壞性因子繼續影響軟骨細胞，自噬不堪重負，自噬活性下降，凋亡活動增強。因此，在晚期OA軟骨中，自噬活性下降。此外，SASAKI等[11]用一氧化氮、白細胞介素-1刺激軟骨細胞，發現軟骨細胞自噬表達增強，這也驗證了筆者的假設，進一步說明至少在軟骨細胞退變的初始階段，自噬表達增強。

本研究針對不同退變階段OA軟骨細胞中自噬相關因子的表達變化規律進行了初步探討，發現自噬在OA軟骨及軟骨細胞退變過程中具有重要的調控作用。在OA引起的各種病理學因素的刺激下，軟骨細胞首先反應性上調自噬相關因子，促進軟骨細胞生存。但是，隨著損傷性因素的持續存在以及不斷增強，自噬水平降低，并導致軟骨內細胞凋亡，最終導致OA的發生、進展。

參考文獻

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收稿日期：2020-12-03;修回日期：2021-01-19