綠豆富硒過程中超氧化物歧化酶活性變化研究

◎ 陳啟鐫，廖文彬

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是生命體中具有活性物質的抗氧化酶，能消除新陳代謝過程中產生的有害物質，持續向人體補充SOD，具有特殊的抗衰老作用，其主要作用是能在生物氧化過程清除自由基[1]，將超氧陰離子自由基（O2-）轉化為過氧化氫，可作為藥用酶[2]預防和治療由自由基引起的各類疾病。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶和過氧化氫酶是生物細胞的保護系統[3]，超氧化物歧化酶主要作用是清除細胞中的超氧陰離子自由基，從而保護生物膜的生物大分子結構免受氧化損傷[4]。而谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化物酶（CAT）和過氧化物酶（POD）分別清除脂質和細胞中的過氧化物和過氧化氫[5]。自19世紀以來，SOD的研究一直被國內外醫學、化學、生物學、食品等領域的學者廣泛關注[6]。近年來，SOD在抗衰老、抗炎、抗癌等機理研究取得了長足進展。

SOD活性測定方法已較成熟，相關活性研究較多。劉銀萍[7]以牡丹品種“洛陽紅”為研究對象，研究其花發育8個時期花瓣的3種抗氧化酶SOD、POD和CAT活性變化，結果表明3種抗氧化酶通過協同作用快速清除機體內產生的O2-，花瓣的衰老受多因素的共同影響，其中抗氧化酶的參與延緩了花瓣的衰老進程。潘百明等[8]采用鄰苯三酚自氧化法測定了紫茄子超氧化物歧化酶（SOD）活性，并對影響SOD活性的因素進行了研究，對不同Tris-HCl緩沖液pH、反應溫度、反應時間、不同丙酮比例進行初步探討。結果顯示，在25 ℃下丙酮比例1∶2，Tris-HCl緩沖液pH=8.2，反應時間20 min為最佳反應條件。隋英忠[9]研究分析復方樹莓提取液中過氧化物歧化酶活力，驗證其在生物體內的抗氧化作用，為深入開發利用樹莓資源提供依據。黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應體系產生超氧陰離子自由基，形成亞硝酸鹽，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力，研究結果表明復方樹莓提取液在生物體內具有一定的抗氧化作用。

目前，SOD的研究大多停留在金屬離子對SOD活性影響上，對其機理的研究多以金屬離子的摻入模式為主，而硒對植物種子生長的影響較少。本研究以綠豆為材料施以Na2SeO3浸泡及萌發處理不同時間，探索Na2SeO3對綠豆SOD的影響，以及Se、總SOD、CuZn-SOD活力之間的關系，為功能性富硒綠豆制品的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售綠豆，選顆粒飽滿，無蟲蛀者。

超氧化物歧化酶測試盒（南京建成生物工程研究所）、亞硒酸鈉（先導稀有金屬化工有限公司，分析純）、乙二胺四乙酸（EDTA，天津市福晨化學試劑廠，分析純）、硒粉（天津科密歐化學試劑開發中心，分析純）、鹽酸羥胺（天津市大茂化學試劑廠，分析純）、甲酚紅（天津市大茂化學試劑廠，優級純）及聚乙烯吡咯烷酮K30（上海伯奧生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

熒光分光光度計（上海現科儀器有限公司，F950）、快速混勻器（蘇州威爾實驗用品有限公司，SK-1）、旋渦混合器（上海精科實業有限公司，XW-80A）、分光光度計（上海第三分析儀器廠，721-100）。

1.3 試劑的配制

0.2 mol·L-1EDTA：稱7.4 g EDTA二鈉鹽，蒸餾水加熱溶解，冷卻后用蒸餾水稀釋至100 mL；混合酸：硝酸∶過氯酸=2∶1；DAN：0.1% 2，3-二氨基萘（純度95%～98%）需在暗室配制，稱取200 mg DAN于一帶蓋三角瓶中，加入200 mL 0.1 mol·L-1鹽酸，振搖約15 min，使其全部溶解；約加40 mL環己烷，繼續振搖5 min，將此液轉入塞有玻璃棉（或脫脂棉）分液漏斗中，待溶液分層后，棄去環己烷層，收集DAN層溶液。

硒標準儲備液（100 μg·mL-1）：精確稱取100.0 mg元素硒（分析純），溶于少量硝酸中，加2 mL過氯酸（70%～72%），置沸水浴中加熱3～4 h，冷卻后加入8.4 mL濃鹽酸，再置沸水浴中煮2 min。準確稀釋至 1 000 mL，此儲備液硒含量為 100 μg·mL-1。

硒標準使用液（0.05 μg·mL-1）：將硒標準儲備液用 0.1 mol·L-1鹽酸稀釋，使含硒為 0.05 μg·mL-1。于冰箱中保存。

1.4 實驗方法

1.4.1 Na2SeO3溶液浸泡對綠豆SOD活性的影響

根據富硒綠豆方法，在35 ℃溫度下用濃度為30 μg·mL-1、3 倍于綠豆重量的 Na2SeO3水溶液分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量[10]。

1.4.2 蒸餾水浸泡對綠豆SOD活性的影響

35 ℃溫度下用3倍于綠豆重量的蒸餾水分別處理綠豆1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量，作為對照。

1.4.3 富硒綠豆萌發后SOD活性的變化

在 35 ℃下、用 3.0 μg·mL-1、3倍于綠豆重量的Na2SeO3水溶液處理5 h，洗凈、去除表面水分后繼續萌發2 h、4 h、6 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量。

1.4.4 正常生長的綠豆萌發后SOD的變化

在35 ℃下、用3倍于綠豆重量的蒸餾水處理5 h，洗凈、去除表面水分后繼續萌發2 h、4 h、6 h，測定總SOD活性、CuZn-SOD活性和蛋白含量以及總硒含量和無機硒含量，作為對照。

1.5 總SOD的提取和測定（SOD測試盒）

1.5.1 總SOD的提取

取處理好的樣品1.00 g于研缽中，加入pH=7.8的磷酸緩沖溶液9 mL，充分研磨，即制成10%的組織勻漿，將勻漿倒入離心管中，4 000 r·min-1離心15 min，所得上清液為SOD粗酶液。

1.5.2 總SOD活性的測定

將SOD粗酶液用生理鹽水稀釋10倍，依表1加入試劑，混勻，室溫放置10 min，與波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，比色?？係OD活力（U·mg-1）按式（1）計算。

表1 SOD測定操作表

1.6 CuZn-SOD的提取和測定（SOD測試盒）

（1）CuZn-SOD的提取。依照南京建成生物工程研究所研制的SDS+KCl抑制法測CuZn-SOD，粗酶液提取同總SOD的提取。

（2）CuZn-SOD的測定。測定步驟同總SOD測定。

（3）CuZn-SOD活性的計算。計算方法同總SOD。

1.7 硒含量的測定

1.7.1 樣品的處理

將樣品用蒸餾水洗凈，放入100 ℃烘箱中5 h，粉碎后4 ℃保存。

1.7.2 樣品的消化

稱取1.000 0 g樣品于磨口三角瓶內，加10 mL 5%硫酸，樣品濕潤后，再加20 mL混合酸液放置過夜。次日于沙浴上逐漸加熱至淡黃色。

測定無機硒及有機硒含量時，稱取1.000 0 g樣品，加入用 4 mol·L-1HCl 30 mL后，170 ℃加熱、回流20 min，冷卻后用定量濾紙過濾雜質。

1.7.3 樣品總硒含量的測定

將樣品消化液定容到100 mL容量瓶中，吸取10 mL于三角瓶中，加40 mL EDTA混合液，用氨水或鹽酸調至淡紅橙色（pH=1.5～2.0）。以下步驟在暗室進行：加6 mL DAN試劑，混勻，置沸水浴中煮7 min，取出后立即冷卻，加6 mL環己烷，振搖4 min，將全部溶液移入分液漏斗，待分層后棄去水層，環己烷層轉入裝有約1 g無水硫酸鈉的帶蓋試管中，于波長360 nm，發射光波長520 nm處測定苤硒腦的熒光強度。

1.7.4 硒標準曲線的繪制

準確吸取硒標準使用液（0.05 μg·mL-1）0 mL、0.4 mL、2.0 mL、4.0 mL及8.0 mL，相當于0.00 μg、0.02 μg、0.10 μg、0.20 μg、0.40 μg 硒，加水至 5 mL，按樣品測定步驟同時進行。

2 結果與分析

2.1 硒標準曲線的繪制

本研究采用標準曲線法測定樣品的硒含量，因此，硒標準曲線的繪制及其線性相關性對于測定結果準確性影響較大。實驗結果（圖1）顯示，硒含量標準曲線為Y=125.34X+1.851 4，在0～0.4 μg范圍，樣品熒光強度與其硒含量之間具有良好的線性關系，相關系數R2=0.997 9。

圖1 硒標準曲線圖

2.2 綠豆對硒的吸收和轉化

由圖2可以看出，外源Se對綠豆中Se含量有顯著影響。隨著浸泡時間的增加，綠豆中總硒含量逐漸增加。從第3 h開始，綠豆中總硒含量明顯上升，當浸泡時間為5 h時，綠豆中Se含量達到12.20 μg·g-1，是對照0.70 μg·g-1的17倍，到了萌芽階段，有機硒占總硒的90%以上。

圖2 浸泡和萌芽過程中綠豆Se含量的變化圖

2.3 綠豆富硒過程中總SOD活性的變化

由圖3可見，隨著浸泡時間的增加，SOD的活性逐漸升高，但當浸泡時間達到3 h后，SOD的活性呈下降趨勢，綠豆中SOD的活性從279.785 U·mg-1降到129.621 U·mg-1，減少了53.7%。隨著浸泡時間的延長，內源硒含量增加，SOD活性增加，過量的硒抑制了綠豆SOD的合成。

圖3 浸泡和萌芽過程中總SOD活性的變化圖

2.4 綠豆富硒過程中CuZn-SOD活性的變化

由4的結果可以看出，在綠豆富硒的過程中，CuZn-SOD活性的變化趨勢與總SOD的變化趨勢大致相同，都是隨著浸泡時間的增加，CuZn-SOD的活性逐漸升高，但當浸泡時間達到3 h后，CuZn-SOD的活性呈下降趨勢。

圖4 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性的變化圖

2.5 綠豆富硒過程中CuZn-SOD活性占總SOD活性的百分率

由圖5可知，CuZn-SOD活性均占總SOD活性60%以上，表明綠豆中SOD主要以CuZn-SOD為主。Na2SeO3浸泡后SOD活性上升，CuZn-SOD活性占總SOD活性比率下降，而在SOD活性下降階段，CuZn-SOD活性占總SOD活性比率上升，說明加硒處理對SOD活性增長和抑制作用主要表現在對Mn-SOD、Fe-SOD活性的作用。

圖5 浸泡和萌芽過程中CuZn-SOD活性占總SOD活性的百分率圖

3 結論

通過對綠豆富硒過程中的硒含量、SOD活性的研究，可以看出：①綠豆用Na2SeO3水溶液浸泡3 h，即硒含量為2.13 μg·g-1時能顯著提高綠豆SOD活性。②綠豆中SOD活性以CuZn-SOD為主，最高是達到總SOD的97.8%，最低時占69.1%。但硒處理對Mn-SOD、Fe-SOD活性無論是增長作用還是抑制作用，都比CuZn-SOD明顯。③含量過高的無機硒對SOD活性的抑制作用強于有機硒。SOD作為植物體內普遍存在的一種專一清除生物氧化中產生超氧陰離子自由基的酶，誘導植物產生更多的SOD，可以用來分離純化，用于食品、藥物、化妝品等領域，仍然是今后的研究課題。