花生油中黃曲霉毒素B1高效液相色譜 檢測方法的探索與研究

◎ 唐國芳

（貴州省黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556000）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是常見的食品污染物之一，其危害極大。黃曲霉毒素有很多種，其中黃曲霉毒素B1（AFTB1）毒性最強，它的毒性比砒霜強幾十倍，對肝臟有嚴重的損傷，是Ⅰ類致癌物。AFTB1化學性質相對穩定，很難溶于水，高溫高壓對它的破壞程度也很小，接近300 ℃時才開始裂解，所以一般的烹調方法對它基本上沒有作用。花生是容易感染黃曲霉的農作物之一，黃曲霉毒素對花生具有極高的親和性。黃曲霉的侵染和黃曲霉毒素的產生不僅發生在花生的種植過程中，而且在加工過程中也會產生。黃曲霉菌廣泛存在于土壤中，菌絲生長時易產生毒素，而生長在土壤之中的花生最容易感染黃曲霉毒素。制作花生油的過程中，大量的花生經過壓榨，其中霉變花生所含的黃曲霉毒素很可能經由這個過程出現在花生油中。

國家市場監督管理總局規定，黃曲霉毒素B1作為重點食品污染物是大部分食品的必檢項目之一。《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）[1]標準規定，花生（油）和玉米（油）的黃曲霉毒素B1限值均為20 μg kg-1，在所有黃曲霉毒素B1限量的食物中限值最高。

本文根據中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心下達的能力驗證計劃——《花生油中黃曲霉毒素B1的測定》（ACAS-PT833—2019），以中檢院提供的盲樣為樣品，以《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）[2]標準為依據，通過優化實驗條件來探索花生油中黃曲霉毒素B1的檢測方法，以加標測回收率來驗證方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀，熒光檢測器，光化學柱后衍生器，3 mL Pribolab黃曲霉毒素總量免疫親和柱。

甲醇-水（70+30）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用鹽酸調節pH至7.4，用水定容至1 000 mL；1% Triton X-100（或吐溫-20）的PBS： 取10 mL Triton X-100， 用PBS定 容 至1 000 mL。所用試劑均為分析純。

黃曲霉毒素B1（AFTB1）標準溶液，標準值2.0 μg·mL-1，由國家農業環境保護科研監測所提供，編號SB05-195-2008。

1.2 分析步驟

1.2.1 標準溶液的配制

將AFTB1標準溶液用甲醇配制成200 ng·mL-1的標準儲備液，再用初始流動相配制成濃度為0.625 ng·mL-1、1.250 ng·mL-1、2.500 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、20.000 ng·mL-1、40.000 ng·mL-1的 標準系列工作液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取5 g樣品（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，準確加入20 mL甲醇-水溶液（70+30）提取液，渦旋混勻，置于渦旋振蕩器中振蕩20 min，在4 000 r·min-1下離心10 min，準確移取4 mL上清液，加入40 mL左右1% Triton X-100（吐溫-20）的PBS，混勻，待過柱凈化。

1.3 樣品的凈化

1.3.1 免疫親和柱的準備

將低溫下保存的免疫親和柱恢復至室溫。

1.3.2 試樣的凈化

免疫親和柱內液體放棄后，將1.2.2處理好的樣品移至50 mL注射筒中，調節下滴速度，控制樣液以1～3 mL·min-1的速度穩定下滴，待樣液滴完后，往注射器筒內分兩次加入20 mL水，以穩定的流速淋洗免疫親和柱，待水滴完后，用真空泵抽干親和柱，最后用4 mL甲醇分4次洗脫，控制洗脫速度在1～3 mL·min-1，收集洗脫液，在500 ℃下用氮氣緩緩吹至近干，用初始流動相定容至1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm有機濾膜，上機檢測。

1.4 加標樣品的處理

稱取空白樣品5 g（精確至0.001 g），準確加入0.5 mL 40 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1的標準溶液，和樣品一起平行處理、凈化、上機檢測算回收率。

1.5 柱后光化學衍生法液相色譜參考條件

流動相：A相甲醇，C相乙腈，D相水（體積比30∶10∶60）；色譜柱：Agilent Poroshell 120 C184.6×150 mm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：30 μL；柱溫：400 ℃；激發波長：360 nm；發射波長：440 nm。

1.6 標準曲線繪制

系列標準工作溶液由低到高濃度依次進樣檢測，以峰面積為縱坐標、以樣品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.7 樣品的測定

試樣中AFTB1的含量計算公式為：

式（1）中：X-試樣中AFTB1的含量，單位為μg·kg-1；C-進樣溶液中AFTB1按照外標法在標準曲線中對應的濃度，單位為ng·mL-1；V1-試樣提取液體積，單位為mL；V3-樣品經免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，單位為mL；V2-用于免疫親和柱的分取樣品體積，單位為mL；m-樣品稱樣量，單位為g。

2 結果與分析

2.1 結果

得到標準曲線回歸方程如圖1所示，標準曲線線性關系良好，相關線性系數達到0.999 9，線性范圍在0.625 ～ 40.000 ng·mL-1。

圖1 標準曲線圖

空白樣品加標回收，回收率達到81.1%。空白加標圖譜圖如圖2所示。

用同樣的條件進黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2的混合標準溶液，分離效果很好，如圖3所示。

圖2 空白加標圖譜圖

圖3 黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2色譜圖

實驗結果經中檢院測試評價中心審核，與測試中心通報的指定值比較，兩個樣品Z值分別為0.1和0.2，獲得滿意結果。

2.2 實驗分析

2.2.1 優化實驗條件

GB 5009.22—2016的分析方法中流動相甲醇、乙腈、水的比例25∶25∶50，經過探索，將甲醇、乙腈、水的比例調整為30∶10∶60，能讓AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG14種物質達到理想的分離狀態。

在樣品前處理時加入吐溫試劑時，國標添加量為23 mL，為了降低緩沖液中甲醇的濃度，本實驗添加量為40 mL。AFTB1易溶于甲醇，先前上柱的提取液要棄去，讓提取液中提取出來AFTB1抗源與免疫親和柱中的AFTB1抗體能夠更充分有效的結合在一起。

洗脫的甲醇與國標相比多了2 mL，這樣雖然增加了氮吹的時間，但能夠充分保證免疫親和柱與抗體結合的黃曲霉毒素B1能夠完全洗下來，提高回收率。

2.2.2 實驗注意事項

免疫親和柱從冰箱中拿出來要放到室溫至少要在0.5 h以上。免疫親和柱內真菌毒素的抗體在20～25 ℃時活性最強，所以樣品上柱凈化處理的環境溫度要控制在20～25 ℃。最后用甲醇洗脫時，第1 mL甲醇加進去后，先把免疫親和柱的下端口堵住，溫育幾分鐘。氮吹結束用1 mL甲醇定容時要充分均勻，讓氮吹管壁上的黃曲霉毒素B1充分溶于甲醇中[3]。

做加標回收，不要馬上加標提取，充分混勻放置過夜，讓標液有充分的時間和樣品混合，增加基質的干擾，增加提取的難度。

黃曲霉毒素B1一般在中性溶液中較穩定，但在強酸性溶液中稍有分解，在pH 9～10的強堿溶液中迅速分解成幾乎無毒的鹽，實驗結束后，所有裝過AFTB1的瓶子，器皿及AFTB1的殘留液均需過pH 9～10的強堿溶液中，使殘留液分解成無毒的鹽，避免對環境造成污染。

3 結論與討論

本次實驗得到了花生油中黃曲霉毒素B1較為理想的檢測方法，此方法可推廣到黃曲霉毒素B族和G族的檢測，通過實驗能夠掌握提高免疫親和柱回收率的幾個關鍵點，對于其他真菌毒素的檢測提供了借鑒。

花生油深受廣大消費者的喜愛，花生油中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素E等有益成分，經常食用可以降低膽固醇，保護心腦血管[4-5]。花生油雖然營養價值豐富，但也不能長期食用，世界衛生組織、中國糧農組織和中國營養學會等權威機構研究得出，當人體膳食中的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸的平衡比例達到1∶1∶1時，才是最健康、完美的營養結構。