葡萄柚皮精油抗氧化性和抑菌活性研究

◎ 呂田華，李苗苗，楊英男，王 琳，劉 陽，姚冰鈺，李 黎，杜麗霞，應(yīng)小川

（1.天津天獅學院，天津 301700；2.天津市韻尼科技有限公司，天津 300000）

葡萄柚又名西柚，是一種蕓香科柑橘，屬小喬木，原產(chǎn)于美國，現(xiàn)在我國南方各省均有栽培[1]。柚皮占整個柚子的43%～48%，含有水分、維生素、礦物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、精油和纖維素等，柚皮精油具有祛痰、止咳、去除自由基、抗菌等作用。但柚皮常作為垃圾處理，不僅浪費而且對環(huán)境造成污染，因此，對柚皮綜合利用給社會產(chǎn)生經(jīng)濟效益[2]。

本實驗為了準確評價葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的能力[3]，測定葡萄柚皮精油與DPPH自由基反應(yīng)平衡時所需的時間；以IC50為評價指標測定不同濃度下，葡萄柚皮精油對DPPH自由基清除率的影響；研究了葡萄柚皮精油對革蘭氏陽性菌枯草桿菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌作用[4-6]，為葡萄柚皮精油工廠化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄柚：市售；菌種：大腸桿菌、枯草桿菌，均由天津天獅學院生物與食品工程學院實驗室提供。

1.2 主要試劑及設(shè)備

DPPH（分析純）：北京路橋技術(shù)股份有限公司；BHT試劑、乙醇溶液均為分析純：國藥集團有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：科泰生物制品有限公司。

XJA-110A高速粉碎機、恒溫培養(yǎng)箱、數(shù)顯式恒溫水浴鍋、磁力攪拌加熱電熱套、PL403電子天平、UV紫外可見分光光度計、電熱恒溫鼓風干燥箱、TD5K-Ⅲ低速離心機、SW-CJ-2D超凈工作臺。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄柚皮精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取葡萄柚皮精油：將新鮮的葡萄柚皮清洗、晾干、切成4 mm×4 mm大小的塊狀，置于蒸餾燒瓶中，以料液比1∶20加入蒸餾水，100 ℃，蒸餾提取2 h，直至無油狀物質(zhì)餾出，用無水硫酸鈉吸附精油中的水分，密封，置于冰箱中備用。

1.3.2 葡萄柚皮精油提取率測定

準確稱取已前處理的新鮮葡萄柚皮，按1.3.1方法提取出葡萄柚皮精油，按照公式（1）計算葡萄柚皮精油提取率：

1.3.3 葡萄柚皮精油DPPH自由基清除率的測定

（1）溶液配制。①DPPH溶液配制。精確稱取DPPH粉末，用70%乙醇完全溶解，搖勻，定容，配制成0.06 mol·L-1的DPPH溶液，得到DPPH貯備液，置于冰箱中冷藏備用。②BHT溶液。準確稱量BHT粉末8 mg，用溶解，搖勻，定容，配制成質(zhì)量濃度為80 mg·L-1的BHT溶液，冷藏備用。

（2）不同反應(yīng)時間對DPPH自由基清除能力的影響。為測定葡萄柚皮精油對DPPH自由基隨時間的變化規(guī)律，分別選用20 μL和60 μL葡萄柚皮精進行測試。向已知試管中分別加入20 μL和60 μL葡萄柚皮精油，DPPH溶液0.6 mL，再加70%乙醇至0.3 mL，搖勻，每隔2 min在波長515 nm下測定吸光度，記錄吸光度值；用同樣的方法，向試管中加入DPPH溶液0.6 mL，BHT溶液100 μL，蒸餾水900 μL，搖勻，每隔2min在波長515 nm下測定吸光度，記錄吸光度值。

（3）葡萄柚皮精油對DPPH自由基清除率的測定。向試管中加入0.6 mL DPPH溶液和0.3 mL葡萄柚皮精油，用0.1 mL70%乙醇，搖勻，避光反應(yīng)1 h后，在515 nm處測定A1值。以0.4 mL 70%乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol·L-1DPPH溶液反應(yīng)后為空白對照A0，利用公式（2）計算DPPH自由基清除率，并繪制葡萄柚皮精油、BHT與DPPH自由基清除率工作曲線，計算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.4 葡萄柚皮精油抑菌活性研究

（1）菌懸液的制備。將大腸細菌、枯草桿菌菌種接種于瓊脂斜面后，37 ℃，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌水，挑選單個菌落進，培養(yǎng)24 h制作菌懸液，菌液濃度約為1.5×108CFU·mL-1，冷藏保存。

（2）培養(yǎng)基的制備。①LB液體培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，加入定量蒸餾水，調(diào)培養(yǎng)基使培養(yǎng)基pH達到7.0，用蒸餾水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。②PDA培養(yǎng)基。采用文獻[7]的方法。

（3）葡萄柚皮精油抑菌能力的測定方法。本實驗采用牛津杯法。移取0.1mL不同菌懸浮液，涂布于相應(yīng)的無菌平板上。將已滅菌的無菌牛津杯（直徑為8.0 mm），分別加入70%乙醇0.2 mL，向另外兩個中滴加5 μL葡萄柚皮精油，置于37 ℃、培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，每個菌種重復5次。測得抑菌圈直徑越大，表示其抑菌活性越強。

（4）葡萄柚柚皮精油抑菌圈直徑試驗判定標準。抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感；抑菌圈直徑7～9 mm為低度敏感；抑菌圈直徑10～14 mm為中度敏感；抑菌圈直徑15～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑＞20 mm為極度敏感。

（5）測定菌株的最小抑菌濃度。本實驗采用試管二倍稀釋法[8]在5個滅菌試管中分別加入LB培養(yǎng)液3 mL，取第1支試管加入精油原液3 mL，混勻后吸取3 mL加入第2支試管，重復操作，直至第5支試管抽取3 mL廢棄，在這5支試管加入待測菌懸液0.1 mL。另設(shè)一管為LB培養(yǎng)液對照組，一管為葡萄柚皮精油為對照組，細菌置37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，以不出現(xiàn)渾濁的最高稀釋倍數(shù)為最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)時間對DPPH自由基清除率的影響

溶液吸光度隨時間變化如圖1所示。由圖1可知，BHT清除DPPH自由基速度比葡萄柚皮精油清除DPPH自由基速度較快，10 min后BHT清除DPPH自由基反應(yīng)達到平衡，為快速抗氧化劑，加入20 μL和60 μL柚皮精油清除DPPH自由基反應(yīng)隨著時間的延長反應(yīng)速度緩慢，得出葡萄柚皮精油為慢速抗氧化劑。由于BHT對DPPH自由基清除時間10 min達到平衡，而葡萄柚皮精油對DPPH自由基清除時間60 min達到平衡，為了與精油做對比性試驗，綜合選擇60 min反應(yīng)時間為測定清除DPPH自由基的反應(yīng)時間。

圖1 溶液吸光度隨時間變化曲線圖

2.2 葡萄柚皮精油對DPPH自由基清除率的測定

葡萄柚皮精油對DPPH自由基的清除率如圖2所示。由圖2可知，隨著葡萄柚皮精油添加量的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，當添加量為250 μL時，DPPH自由基清除率變化趨于平緩。由圖3可知，隨著BHT添加量的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，當添加量為120 μL時，DPPH自由基清除率變化趨于平緩。

圖2 葡萄柚皮精油對DPPH自由基的清除率曲線圖

圖3 BHT溶液對DPPH自由基的清除率曲線圖

根據(jù)圖2、圖3，葡萄柚皮精油、BHT的回歸方程與半數(shù)清除率見表1。由表1可得，葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的IC50為160.81 μL，BHT溶液清除DPPH自由基清除的IC50為88.31 μL，通過半數(shù)清除率的比較，BHT溶液的清除能力較強，葡萄柚皮精油也具有清除DPPH自由基的能力，但與人工合成的抗氧化劑BHT清除自由基能力上存在差距。

表1 精油、BHT回歸方程與半數(shù)清除率表

2.3 葡萄柚皮精油的抑菌性

葡萄柚皮精油對大腸桿菌與枯草桿菌的抑菌效果見圖4。葡萄柚皮精油對大腸桿菌和枯草桿菌得的抑菌圈直徑測定為（11.4±0.32）mm和（15.2±0.18）mm。在相同條件下，葡萄柚皮精油對大腸桿菌的抑菌活性比葡萄柚皮精油對枯草桿菌的抑菌活性更強，葡萄柚皮精油對大腸桿菌屬于中敏感度，對枯草桿菌屬于高敏感度，本結(jié)果與錢驊等人[9]的研究結(jié)論相同，實驗表明葡萄柚皮精油對大腸桿菌和枯草桿菌均有抑制作用。

圖4 葡萄柚精油對大腸桿菌與枯草桿菌的抑菌圈圖

2.4 葡萄柚皮精油對不同菌種的最小抑菌濃度（MIC）

MIC的高低能反映出葡萄柚皮精油對不同菌種的抑菌效力，MIC越高，抑菌效果就越弱，反之，抑菌效果就越強，由表2可知葡萄柚皮精油對不同菌種的最小抑菌濃度，測定結(jié)果與牛津杯法結(jié)果一致。

表2 葡萄柚皮精油對不同菌種的最小抑菌濃度表

3 結(jié)論

（1）通過測定不同反應(yīng)時間對DPPH自由基清除率的影響，試驗得出在60 min左右葡萄柚皮精油對DPPH自由基清除反應(yīng)達平衡。

（2）以BHT為對照，得到葡萄柚皮精油具有清除DPPH自由基的能力。

（3）葡萄柚皮精油對革蘭氏陽性菌枯草桿菌、陰性菌大腸桿菌都有抑菌效果?？莶輻U菌抑菌效果為高度敏感。

（4）葡萄柚皮精油對枯草桿菌的最小抑菌濃度為 7.31 mg·mL-1；大腸桿菌其次，為 10.92 mg·mL-1；測定結(jié)果與牛津杯法測定出的一致。

本實驗通過從葡萄柚皮中提取精油，不僅可使葡萄柚原料綜合利用率提高，增加葡萄柚產(chǎn)品的附加值以及經(jīng)濟效益，同時還可減少對環(huán)境的污染。