油茶籽仁中茶皂素的提取與分析

◎ 張洺榛，廖小麗

（1.湖北江曉環保科技有限公司，湖北 武漢 430000；2.武漢海關技術中心，湖北 武漢 430000）

油茶作為21世紀重要的木本油料作物之一，近年來一直被作為研究熱點為廣大學者所熱衷。油茶的主要利用部分為油茶果，油茶果主要由油茶外殼、油茶籽殼、油茶籽仁三大組分構成[1]，其中，油茶籽仁除含有大量的不飽和脂肪酸外，蛋白質、糖類、茶皂素等也是其主要成分，同時油茶籽仁還含有植物甾醇、角鯊烯等微量活性成分。在這些組分當中，茶皂素又是其中的熱點。茶皂素又被稱為茶皂苷，熔點約224 ℃，平均分子式為C57H90O26，相對分子質量為1 200～2 800，是一種天然的糖苷化合物[2]，同時也具備這一類物質的通性——易溶于乙醇和甲醇，但是難溶于無水甲醇和無水乙醇，不溶于石油醚、苯等有機試劑。由于其具備抗菌、抗病毒、降血脂等諸多優勢，茶皂素被廣泛地應用于醫美、食品等領域[3]。

油茶是我國的特色植物，在國外的種植較為稀少，所以國外學者對于油茶及其相關物質的研究不多[4]。而國內學者提取茶皂素的方法主要分為水提法和醇提法兩種，經有關學者試驗得知，水提法提出來的茶皂素相對于醇提法來說雜質多一些，但是水提法相對成本低廉，所以這兩種方法在實際的工業生產當中都有所應用[5]。本文采用80%熱乙醇溶液（75 ℃）進行浸提，為了保證其得率，采用復提取的方法進行提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采用湖南衡陽產地曬干帶殼茶籽。茶皂素分析標準品（純度≥98%，阿拉丁）。無水乙醇（AR）、硫酸（1.86 g·mL-1）、香草醛（AR）、石油醚（30～60 ℃，AR），試劑均為上海國藥集團生產；純水（滿足實驗室三級水及以上），實驗室常用材料及耗材。

1.2 儀器與設備

E7221型紫外-可見分光度計及其配套器材；me2041型電子天平（感量為0.000 1 g）；HH-S1型恒溫水浴鍋；101-4B型鼓風干燥機；HU10300/40B型超聲清洗機；2500型粉碎機。

1.3 溶液配制

80%乙醇溶液（V/V）：4份無水乙醇加1份純水，充分混勻；1 mg·mL-1茶皂素標準溶液：準確稱取100 mg樣品，用80%乙醇溶液溶解并定容至100 mL；77%硫酸溶液（V/V）：將77.00 mL硫酸（1.86 g·mL-1）用玻璃棒緩慢引流至盛有23.00 mL純水的200 mL燒杯中；8%香草醛溶液（W/V）：將4 g香草醛固體溶于50.00 mL的80%乙醇溶液中。

1.4 樣品預處理

1.4.1 去殼處理

將200 g左右茶籽裝在網袋中用木錘進行捶打，使油茶籽殼與油茶籽仁分離，然后挑選出茶籽仁。在這個過程中需要將所有茶籽分離，保證樣品的均一性，同時在捶打過程中應當嚴格控制好力度，防止樣品破碎導致出油率過高出現黏連等現象，引入過大的誤差。

1.4.2 粉碎

將步驟1.4.1中分離的油茶籽仁放入粉碎機中粉碎，粉碎后過20目篩，樣品過篩率要達到95%以上且不可以強行過篩，過篩完后將樣品混勻，裝袋備用。

1.4.3 含水率測定

通過重量法進行含水率測定，在烘干、干燥、恒重后的鋁盒中加入步驟1.4.2中樣品（10.0±0.1）g，蓋上鋁盒放入烘箱烘干至恒重，以上遵循國家標準《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）。該步驟是為了能夠校正后面測定樣品的實際質量，從而使結果誤差有效降低。

1.4.4 索氏提取

以石油醚做提取劑用感量為0.000 1 g的電子天平稱取步驟1.4.2中樣品（1.00±0.01）g，按照索氏提取的操作規程用濾紙將樣品包起來，折成適宜大小放入虹吸管進行索氏提取，時間為6 h。該步驟是為了充分將油清除，防止后面在顯色時干擾實驗結果。

1.4.5 干燥

將索氏提取完成后的濾紙包取出，放入鼓風干燥機中（70±2）℃恒溫烘干30 min，將殘留的石油醚蒸發耗盡。

1.4.6 乙醇提取

將干燥后的濾紙包放入100 mL的錐形瓶中，加入50 mL的80%乙醇溶液，封上封口膜，在75 ℃的條件下恒溫水浴提取2 h，其間超聲3～5次，到時間后將燒瓶中的殘余液直接轉移至250 mL容量瓶中，并用80%乙醇溶液清洗幾遍，清洗濾液也轉移至同一個250 mL容量瓶中。重復以上步驟進行乙醇復提取。

1.4.7 轉移、定容

將兩次提取液最終都放置在一起，并按照定容相關操作用80%乙醇溶液定容至刻度線。期間，定容至250 mL容量瓶約2/3處進行充分搖勻，定容結束后蓋上玻璃塞進行上下搖勻，再將玻璃塞旋轉180°后再度搖勻，確保溶液的均一性。

1.5 實驗方法

1.5.1 上機前

用移液管準確吸取1 mL步驟1.5.7中定容后的溶液至玻璃試管中，加入0.5 mL的8%香草醛溶液，再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。

1.5.2 上機測試

將步驟1.5.1中冰水浴后的樣品用紫外-可見分光光度計在533 nm進行測試，記錄下吸光度A。

2 結果與分析

2.1 提取次數確定

在本次實驗中，提取率與提取次數的關系如表1所示。

表1 油茶中茶皂素提取率與提取次數的關系表

假設在第4次茶皂苷提取完全，在第1～3次的相對得率分別為76.56%、94.36%、97.32%，出于綠色化學理念和實驗成本等多方面進行綜合考量，提取2次是最佳實驗方案。

2.2 標準曲線的制作與確定

選取6支玻璃試管，編號1、2、3、4、5和6，用移液管分別準確吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的1 mg·mL-1的茶皂素標準溶液，分別加入80%乙醇溶液0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.0 mL；再分別加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。

最大吸收波長的選擇：將2、4、6號管的溶液在400～780 nm，間隔1 nm區間進行光譜掃描，最終確定533 nm為最大吸收波長，即實驗測定波長。

按照以上操作，以吸光度為縱坐標，以茶皂素濃度為橫坐標，繪制標準曲線如圖1所示，回歸方程為y=0.796 7x-0.004 2，相關系數R2=0.999 6。

圖1 茶皂素標準曲線圖

2.3 油茶籽仁中茶皂素含量測定

測得樣品濃度分別為16.05%、16.18%、16.14%，平均濃度為16.12%。經過測定，茶籽含水率為5.73%，則茶皂素的實際濃度為17.10%。

2.4 精密度試驗

經過計算，相關數據相對平均偏差為0.33%，符合化學分析相關要求，即數據證明有效。

2.5 加標回收率

重新選擇6根玻璃試管，分別加入0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL樣品，再分別加入0.1 mL的1 mg·mL-1茶皂素標準溶液，用80%乙醇溶液補到1 mL，再加入0.5 mL的8%香草醛溶液，然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液，充分混勻后60 ℃水浴15 min，緊接著冰水浴10 min。經測定，該方法的加標回收率為95.8%～101.3%如表2所示，符合化學分析相關要求，即數據證明有效。

表2 加標回收率測試原始數據表

3 結論

通過香草醛-濃硫酸法測定茶皂素含量，雖然在整個過程中會受到油脂的干擾以及反應時間的影響，但是相對于HPLC測定茶皂素來說，此方法更為便捷、消耗時間也更少，不需要進行過多的操作，為后續的類似實驗處理提供了便捷途徑。

本方法各項指標均符合化學分析的相關要求，但由于實驗影響因素較多，所以導致部分細節方面有待商榷，在后續的實驗中，應該更加注重一些細節性的問題，使油茶果中茶皂素的提取和測定更加精確。同時，由于茶皂素物質組成較為復雜，導致該實驗不一定是最佳的測試條件，這也是茶皂素目前為止沒有制定統一標準的原因之一。對于茶皂素測定的進一步規范化，還有待其他學者的進一步深入研學，從而找到一個公認的優良方法。